Mécanismes de régulation de la réplication des acides nucléiques. Régulation de la réplication de l'ADN dans une cellule

Un examen détaillé des mécanismes moléculaires de régulation de la réplication de l'ADN dépasse le cadre du livre, nous nous limiterons donc à quelques commentaires sur cette question et discuterons plus en détail uniquement du mécanisme de régulation de la réplication chez E. coli, y compris les plasmides bactériens, qui sont directement liés au fonctionnement des vecteurs plasmidiques dans les cellules bactériennes.

La synthèse de l'ADN est étroitement liée à d'autres processus qui préparent la division cellulaire, puisque le transfert de l'information génétique nécessaire des cellules mères aux cellules filles est vital pour les cellules descendantes. La présence d’un excès d’information génétique affecte négativement la viabilité des cellules, tandis que son déficit, résultant d’une sous-réplication de l’ADN, conduit à un effet mortel dû à l’absence de gènes vitaux. Cependant, le processus de transfert d’informations génétiques des cellules mères aux cellules filles chez les eucaryotes ne se limite pas à une simple reduplication de l’ADN chromosomique. Ainsi, pour les insectes de nombreuses espèces, la présence de géants polyéthylène chromosomes résultant de plusieurs cycles de réplication de l'ADN des chromatides d'origine, non accompagnés de leur divergence.

Polyténisation Les chromosomes représentent une large classe de phénomènes génétiques associés à une réplication redondante sélective ( animation) ou sous-réplication de loci génétiques eucaryotes individuels. Un exemple frappant de ce type est la modification du nombre de gènes d’ARN ribosomal chez les animaux. L'amplification des gènes d'ARNr dans les ovocytes d'amphibiens se produit par la formation de leurs copies extrachromosomiques (extrachromosomiques) sous la forme de molécules d'ADN ribosomique (p) circulaires, qui sont ensuite répliquées par le mécanisme de « l'anneau roulant ». Dans le même temps, une seule des centaines de répétitions d'ADNr est amplifiée dans chaque cellule, de sorte que l'amplification de l'ADNr sur une répétition supprime d'une manière ou d'une autre le processus d'amplification sur les autres, et toutes les répétitions formées dans un ovocyte sont identiques, mais diffèrent de la ensembles d’ADNr amplifié d’autres ovocytes. Une spécificité stricte de stade et de tissu, ainsi qu'une amplification sélective d'une seule répétition d'ADNr, indiquent également la présence de mécanismes de régulation fins du processus de réplication dans ce cas.

Des exemples typiques d'une augmentation du nombre de gènes due à leur réplication sélective sont grossissement Gènes d’ARNr et modifications du nombre de gènes qui déterminent la résistance cellulaire aux médicaments. Dans le premier cas, la perte d'une partie des gènes de l'ARNr chez la drosophile par délétion s'accompagne d'une restauration progressive de leur nombre, tandis que dans le second cas, le nombre de copies des gènes nécessaires à sa neutralisation augmente dans les cellules. dans les conditions de l'action sélective d'un médicament toxique pour eux. Ceci est notamment caractéristique du gène de la dihydrofolate réductase en présence de méthotrexate. Il est suggéré que la modification du nombre de copies de ces gènes est basée sur le mécanisme de croisement inégal.

La réplication des chromosomes bactériens est étroitement associée au métabolisme cellulaire. Par exemple, la fréquence d'initiation de nouveaux cycles de réplication dépend du taux de croissance des cellules bactériennes, et les cellules de bactéries à croissance rapide peuvent contenir des chromosomes avec plusieurs fourches de réplication fonctionnelles, bien que seulement deux soient nécessaires pour la réplication d'un chromosome bactérien, initiée en une origine de réplication unique (ori) et divergeant en sens opposés. Cela permet aux bactéries, dans des conditions favorables, de consacrer moins de temps à la génération qu'à la réplication complète du chromosome bactérien. De toute évidence, pour maintenir un caractère strictement ordonné de la réplication, il doit exister des mécanismes subtils de régulation de la réplication au niveau du lancement de nouveaux cycles. De tels mécanismes existent.

Actuellement, les mécanismes les plus étudiés sont les mécanismes de régulation de la synthèse de l'ADN chez E. coli, y compris les mécanismes de contrôle du nombre de copies dans le petit plasmide ColE1 d'E. coli, qui seront discutés ci-dessous plus en détail en raison de l'importance de ces phénomènes pour la génétique. ingénierie.

La réplication se produit après que la cellule a dépassé un point de restriction ou START

La réplication est régulée par étapes et coordonnée avec le début de la mitose

La réplication se produit à des points d'initiation, qui peuvent avoir une structure primaire spécifique, une position spécifique ou être situés dans l'ADN à des distances spécifiques.

L'initiation se produit uniquement aux points autorisés capables de réplication

Ayant rempli leurs fonctions, jusqu'au début du cycle suivant, les origines de réplication ne peuvent pas être réutilisées

Quand cellules analysé l'état de l'environnement et décidé d'entrer dans un cycle de division, ils passent le point G1/S et commencent la réplication de l'ADN. Comment les cellules combinent-elles et activent-elles les facteurs nécessaires à la réplication de l’ADN ? Quels mécanismes de contrôle garantissent qu’une cellule ne réplique l’ADN qu’une seule fois, et une seule fois par cycle ?

Même s'il n'est pas encore possible de donner des réponses complètes à ces questions des questions, en identifiant et en analysant la séquence d'ADN chromosomique de levure capable de réplication indépendante, de nombreuses informations ont été obtenues sur le processus de réplication de l'ADN lui-même. Ces séquences dans le chromosome, appelées séquences à réplication autonome (ARS), font partie des origines de réplication. Le point d'initiation ou de départ (origine de la réplication) est la région de la séquence d'ADN à laquelle commence la réplication.

La levure en herbe, mais pas la plupart d'autres organismes, les origines de réplication sont représentées par de petites séquences consensus. Chez la levure confluente, ces points occupent de vastes régions d'ADN riches en paires AD, mais ne diffèrent par aucune structure particulière. Chez d'autres eucaryotes, les origines de réplication sont localisées de manière aléatoire, en fonction de la répartition des protéines associées de manière non spécifique à l'ADN dans tout le génome.

Afin de garantir les délais duplication du génome, il doit y avoir un nombre suffisant d'origines de réplication sur le chromosome. Les bactéries n’ont besoin que d’une seule origine pour répliquer un seul chromosome circulaire, mais les eucaryotes, qui possèdent un vaste génome réparti sur de nombreux chromosomes linéaires, doivent avoir plusieurs origines de réplication. Chez la levure en herbe, dont la taille du génome est d'environ 13 Mo, il existe environ 400 origines de réplication sur 16 chromosomes.

Cela crée plusieurs problèmes avec régulation du processus de réplication. Le fonctionnement des origines de réplication doit être coordonné avec le cycle cellulaire pour que la réplication ne démarre que pendant la phase S. Il doit y avoir une certitude totale que la réplication est terminée avant que la cellule n'entre en mitose. Chacune des origines de réplication n'a besoin de fonctionner qu'une seule fois pour garantir que l'ADN n'est répliqué qu'une seule fois par cycle.

Tout au long du cycle cellulaire, l'0RC est associé à l'origine de réplication sur le chromosome.
En peu de temps, de la fin de la mitose à G1, les protéines activant la réplication se lient également à l'origine,
Cdc6 et Cdt1, qui à leur tour activent le complexe hélicase hexamère MCM (MCM2-7).
Cette étape finalise le retrait du bloc de réplication et l'assemblage du pré-RC.

Points de départ réplication se lier aux facteurs nécessaires pour activer la réplication et initier la synthèse de l’ADN. L'initiation de la réplication de l'ADN se produit uniquement aux points contenant des facteurs associés et sont donc considérés comme des points autorisés. Cependant, chaque cycle de réplication de l’ADN dans le processus implique un ensemble limité de points de départ potentiels présents sur les chromosomes. De plus, comme différents points de départ activés sont activés à des moments différents, les événements déclencheurs se produisent également à des intervalles de temps différents. Par exemple, certains points sont activés au début de la phase S, tandis que d’autres entrent dans cet état plus tard.

On ne sait pas ce que c'est facteur temps, mais il semble que l'emplacement d'une origine spécifique de réplication sur un chromosome détermine le moment où elle se produit.

Pour que la réplication démarre, un complexe préréplicatif(pré-RC). À la suite d'études génétiques sur la levure et d'expériences biochimiques sur des extraits d'ovocytes de Xenopus, un modèle d'assemblage pré-RC a été révélé. Le processus commence par la liaison de l’ADN à un complexe de six protéines appelé complexe de reconnaissance d’origine (ORC). Ce complexe marque une origine potentielle de réplication, mais il n'est pas suffisant pour l'activation. Il sert de plate-forme pour lier deux autres protéines conservées : Cdc6, qui appartient à la famille AAA+ATPase, et Cdt1. (De nombreuses protéines dotées d'un domaine ATPase utilisent l'énergie de l'ATP pour faire leur travail.)

Puis le complexe les rejoint supportant les minichromosomes(complexe de maintenance des minichromosomes, MSM), qui est une structure cyclique composée de six protéines apparentées, qui appartiennent également à la grande famille des AAA + ATPase. Les complexes MSM sont présents en excès et se propagent au-delà de l'origine de réplication. Lors de la connexion, MCM, ORC et Cdc6 deviennent des composants facultatifs et le pré-RC entre dans un état capable d'être activé. L'ordre des événements qui se produisent lors de l'assemblage pré-RC aux origines de réplication est schématisé dans la figure ci-dessous.

assemblage pré-RC est limité par l'intervalle entre la fin de la phase M et le début de la phase S, ce qui s'explique par les raisons suivantes. Premièrement, le niveau de protéine Cdc6 dans la cellule est contrôlé de telle manière qu’elle n’est présente que pendant cette période. En l'absence de la protéine Cdc6, la protéine MSM ne se lie pas à l'origine de réplication. Deuxièmement, chez les métazoaires, la protéine Cdt1 est régulée négativement par une autre protéine, la géminine, qui bloque son activité à toutes les périodes, à l'exception de la fenêtre G1. Enfin, l’assemblage du pré-RC lui-même est limité par l’activité du complexe mitotique CDK-cycline.

Les substrats de ce complexe sont des sous-unités ORC, CDC6 Et HSH. Lors de la phosphorylation, Cdc6 est inactivé et la phosphorylation de la protéine MCM en phase S provoque son clivage de l'ADN. Par conséquent, le pré-RC ne peut se former qu’en cas de faible activité du complexe CDK-cycline. Ceci est caractéristique de l'intervalle entre les niveaux élevés d'activité du complexe mitotique CDK-cycline en phase M et en phase S, lorsqu'il augmente à nouveau, contribuant à l'activation de l'origine de réplication.

Comment faire le point début de la réplication transition de l'état préréplicatif à l'état réplicatif ? Cette transition nécessite la formation de nombreux complexes protéiques supplémentaires, et le processus est sous le contrôle de deux kinases, le complexe CDK-cycline et Cdc7-Dbf4 (DDK). Ainsi, l'activité du complexe CDK-cycline coordonne les processus de réplication et le cycle cellulaire. Dans ce cas, la coordination peut être à la fois négative (empêchant l’assemblage pré-RC et donc le refonctionnement des origines de réplication) et positive (favorisant l’activation des origines de réplication). Parmi les questions en suspens figure celle des substrats de kinases qui favorisent l’initiation de la réplication.

Si complexes CDK-cycline assurer la coordination des processus tout au long du cycle, puis DDK agit au niveau des points individuels qui lancent la synthèse de l'ADN. Parmi les substrats les plus connus de cette kinase figurent les protéines MCM elles-mêmes. Il est intéressant de noter qu’une mutation ponctuelle du gène Mcm5 supprime le besoin de présence de DDK. Ceci suggère que la phosphorylation entraîne une modification de la structure de la protéine MSM, ce qui provoque l'initiation de la réplication. Toutefois, les données disponibles indiquent que ces changements sont extrêmement faibles. Les processus de contrôle de la réplication de l'ADN impliquant CDK et DDK sont présentés.

Probablement le processus limitant de l'initiation réplicationà des points de départ distincts se trouve la liaison de la protéine Cdc45, qui nécessite à la fois le complexe CDK-cycline et DDK. La liaison de cette protéine, qui s'accompagne de la formation d'un complexe supplémentaire appelé GINS, conduit au déroulement de l'hélice d'ADN au point de départ, du fait de l'activation du complexe MCM, agissant comme une hélicase. Ainsi, le MSM est converti d'un facteur d'assemblage impliqué dans la formation du pré-RC en une enzyme hélicase, qui fait partie du complexe d'élongation. Le déroulement de la double hélice de l'ADN à l'origine de la réplication conduit à la formation d'ADN simple brin, qui se lie à une protéine RPA spécifique appartenant au groupe de protéines qui se lient à l'ADN simple brin (protéines de liaison à l'ADN simple brin).

À son tour, Protéine RPA favorise la liaison du complexe primase/ADN polymérase alpha, qui initie la synthèse de l'ADN. Le complexe de MSM et de Cdc45 se déplace le long de l'ADN, formant une fourche de réplication en expansion qui forme un grand réplisome qui comprend principalement l'ADN polymérase 6 plutôt que la polymérase a. Les processus d'initiation de la réplication de l'ADN sont présentés dans la figure ci-dessous. Les points de contrôle et les systèmes de réparation de l'ADN participent au maintien du fonctionnement du réplisome et à la protection de l'ADN dans la zone de la fourche de réplication contre les dommages.

Dès que HSHéloigné de l'origine de réplication, il est considéré comme « utilisé » et ne peut être réactivé qu'à la fin de la phase M suivante, jusqu'à ce que le pré-RC soit à nouveau formé à l'origine. Au fur et à mesure que la phase S progresse, les MSM sont éliminés de la chromatine. Parallèlement à cela, lors du mouvement de la fourche de réplication, des liaisons sont établies qui relient les chromatides sœurs nouvellement formées avant le début de la mitose. Ainsi, l'achèvement de la phase S est associé à la formation des structures nécessaires à la ségrégation correcte des chromosomes en mitose, ce qui indique la formation de liens entre les différentes phases du cycle cellulaire.

La fonction des origines de réplication est également régulée au niveau de l'ensemble chromosomes. Il convient de rappeler que dans une cellule, à l'aide de nucléosomes, elle est emballée dans la chromatine, ce qui lui impose un certain nombre de restrictions structurelles. Cette circonstance peut affecter l'organisation temporelle de la réplication ; par exemple, toutes les origines de la phase S ne se répliquent pas en même temps. Dans certains cas, le moment relatif du début de l'activation des origines de réplication peut être déterminé non pas par le point lui-même, mais par son emplacement sur le chromosome. Les points situés à proximité de l'euchromatine transcriptionnellement active s'initient plus tôt que ceux situés à proximité de l'hétérochromatine transcriptionnellement inactive, qui s'initient généralement à la fin de la phase S.

4.2.1 Initiation de la réplication de l'ADN chez E. coli et sa régulation

La réplication de l'ADN chromosomique chez les bactéries joue un rôle clé dans leur cycle de vie. Au cours de ce processus, les micro-organismes dupliquent leur génome et les génomes filles qui en résultent passent ensuite dans les cellules filles. La grande précision avec laquelle les bactéries effectuent de tels processus indique la présence de mécanismes spéciaux pour leur coordination et leur contrôle.

^ Structure de la zone de démarrage de la réplication oric. Le chromosome d'E. coli contient un seul origine de la réplication(origine) nommé oric, sur lequel la réplication est initiée (Fig. I.47, UN). La taille de la région minimale d'origine de réplication, qui assure la réplication autonome du chromosome, est de 258 pb. (position 11-268 sur la Figure I.47). Une comparaison des structures primaires des régions d'origine de réplication de diverses entérobactéries a montré que leurs séquences sont représentées par de courtes régions conservées, entrecoupées de segments d'ADN divergents, dont les longueurs sont cependant hautement conservées. Les régions conservées se sont révélées être des sites de liaison pour des protéines régulatrices séparées par des séquences espaceurs. Oric contient cinq sites de liaison initiateurs consensus de 9 nucléotides DnaA (répétitions non palindromiques) appelés boîtes DnaA. Chez toutes les Enterobacteriaceae, les origines de réplication contiennent 9 à 14 sites GATC, dont la position de huit est conservée.

Sur le côté gauche oric il existe une région riche en AT contenant trois séquences similaires de 13 nucléotides de longueur, dont chacune commence par GATC. Le cluster AT est également localisé ici, qui, avec la séquence gauche de 13 nucléotides, forme une zone d'hélice d'ADN instable ( Élément de déroulement de l'ADN). Cette section d'ADN peut être remplacée sans perte de fonction par une composition nucléotidique similaire, mais avec une séquence nucléotidique différente.

Oric contient des sites de liaison pour les protéines qui plient l'ADN, l'IHF (facteur hôte d'intégration) et le FIS (facteur de stimulation d'inversion). Les deux protéines semblent aider l’initiateur DnaA à dérouler l’ADN.

La protéine dimère IciA, constituée de sous-unités d'un poids moléculaire de 33 kDa, se lie spécifiquement aux répétitions 13-mères riches en AT. La fonction de cette protéine est inconnue, tout comme celle de la protéine Rob, qui interagit spécifiquement avec le site de 26 pb situé sur le côté droit de la boîte R4 DnaA. L'ADN proche du site Rob présente une courbure plus prononcée dans les molécules entièrement méthylées avec la méthyltransférase Dam (voir ci-dessous). Un tel ADN entièrement méthylé interagit avec la protéine de type histone H-NS, dont le site de liaison chevauche le site Rob. Cette interaction affecte le fonctionnement oric.

Riz. I.47. La structure de la région d'origine de la réplication du chromosome d'E. coli ( UN) et le schéma pour lancer sa réplication ( b)

HobH est une protéine qui interagit avec une région d'ADN méthylée simple brin de l'origine de la réplication (liaison d'origine hémiméthylée)
^ Fonctions de la protéine DnaA. La protéine DnaA joue un rôle clé dans l’assemblage répliques- un complexe protéique à plusieurs composants qui effectue la synthèse bidirectionnelle de l'ADN. La protéine reconnaît l'origine de la réplication et attire les composants protéiques restants du réplisome vers le site d'assemblage.

^ Étapes d'initiation de la synthèse de l'ADN sur oric. Assemblée original complexe commence par l'interaction de la protéine DnaA avec les boîtes DnaA R1–R4 et M (voir Fig. I.47, b). Pour réussir les étapes suivantes de l'assemblage du réplisome, la protéine DnaA doit être en complexe avec l'ATP et interagir avec le superenroulé. oric. À l'aide d'un microscope électronique, le complexe initial est détecté comme une structure ellipsoïdale compacte contenant 20 monomères DnaA, qui se ferme oric. Le complexe initial présente une structure très ordonnée.

En présence d'ATP à forte concentration (5 mM), le complexe initial est transformé en complexe extérieur. Dans ce complexe, déroulement partiel des répétitions de 13 nucléotides riches en AT situées sur le côté gauche du oric. À 37° ou plus, une seule protéine DnaA peut assurer le déroulement de l’ADN. La formation d'un complexe ouvert à des températures plus basses nécessite la participation de la protéine structurante HU ou du facteur d'intégration de la bactérie hôte IHF. Dans le complexe ouvert, de petites zones d’ADN non torsadé se trouvent sur le côté droit oric entre les cases DnaA R2 et R4, qui sont considérées comme des sites d'atterrissage d'hélicase.

La protéine DnaB est une hélicase de la fourche de réplication et entre dans un complexe ouvert pour former complexe de préamorçage I, interagissant avec des régions simple brin d'ADN partiellement non torsadé. Ces sites sont préparés par la protéine DnaA, qui déplace la protéine SSB des sites correspondants. DnaB entre dans le complexe de pré-amorçage I sous forme d'hexamères complexés avec six monomères DnaC, dont chacun se lie à une molécule d'ATP. Dans ce complexe, l’activité hélicase de la protéine DnaB est bloquée. La libération de DnaC du complexe résulte de l’hydrolyse de l’ATP. La conséquence en est l’activation de l’hélicase DnaB et sa localisation correcte dans le complexe. La combinaison de ces événements transforme le complexe de préamorçage I en complexe de préamorçage II.

L'hélicase devrait commencer à fonctionner au début du fork de réplication sur le côté droit oric près des cases DnaA R2, R3 et R4. Pour ce faire, il doit être transféré du lieu de son entrée initiale dans le complexe jusqu'au point d'origine de la réplication. On suppose que la translocation est associée à la libération dépendante de l'ATP du complexe protéique DnaC, qui s'accompagne d'une activation de l'hélicase.

DANS complexe d'amorçage L'hélicase DnaB interagit avec la primase DnaG, qui joue un rôle clé en garantissant l'initiation de la réplication précisément sur oric. Ces deux enzymes assurent la conjugaison du fonctionnement de deux fourches de réplication se déplaçant dans des directions opposées. Dans un système acellulaire, à de faibles concentrations de primase, la réplication devient unidirectionnelle et peut ne pas être initiée dès le début. oric. Dans le complexe d'amorçage, la présence de la protéine DnaA n'est plus requise, et après avoir été libérée du complexe, elle peut être réutilisée pour initier la réplication sur un autre complexe. oric. On pense que lors de l'assemblage coordonné de deux fourches de réplication, une amorce est synthétisée dans l'une d'elles, qui devient une amorce lors de la synthèse du brin leader par l'autre fourche de réplication se déplaçant dans le sens opposé. La primase dans le complexe d'amorçage fonctionne par un mécanisme distributif. Après la synthèse de l'amorce, elle quitte la fourche de réplication et est remplacée par une nouvelle molécule primase lors de la formation du prochain fragment d'Okazaki.

Lors de la formation d'un réplisome dans chaque fourche de réplication, il se produit une formation dépendante de l'ATP d'un complexe dimère de l'holoenzyme ADN polymérase III associé aux extrémités 3' des amorces (pince coulissante, voir ci-dessus), suivie d'un allongement coordonné. des amorces, accompagnée d'une synthèse bidirectionnelle des chaînes d'ADN principales et en retard. Dans un système acellulaire, les points de départ de la synthèse des chaînes principales sont localisés dans oric près des cases DnaA R2, R3 et R4.

^ Mécanismes de contrôle de l'initiation de la réplication in vivo. L'initiation de la réplication de l'ADN chez E. coli est régulée à au moins trois niveaux : 1) l'initiation est synchronisée avec le cycle cellulaire ; 2) la synthèse de l'ADN dans chaque région d'origine de réplication dans le cycle cellulaire n'est initiée qu'une seule fois ; 3) l'initiation se produit de manière synchrone dans toutes les régions d'origine de réplication présentes dans une cellule bactérienne donnée. Il a été établi que la synthèse de l'ADN commence après que la masse d'une cellule bactérienne par région d'origine de réplication atteint une certaine valeur, appelée initiation de masse(messe d'initiation). La protéine DnaA est actuellement considérée comme le principal stimulateur cardiaque, jouant un rôle clé dans le contrôle de l’initiation de la réplication.

La suppression de la synthèse protéique in vivo s'accompagne de l'achèvement de la synthèse d'ADN déjà initiée dans le contexte de la fin de nouveaux cycles d'initiation. La reprise de la synthèse protéique conduit à l'initiation de la réplication après un délai d'une génération cellulaire. En présence de toutes les protéines nécessaires, l'initiation est sensible à la rifampicine, un inhibiteur spécifique de l'ARN polymérase bactérienne, ce qui indique la dépendance de l'initiation à la synthèse d'ARN non traduit.

Rôle de la topologie oriC dans l'initiation de la réplication . La topoisomérase I et la topoisomérase II (ADN gyrase) maintiennent le chromosome bactérien dans un état de surenroulement négatif. Environ la moitié des super-enroulements sont neutralisés par les protéines de type histone HU, IHF et FIS, tandis que le super-enroulement restant du chromosome bactérien facilite la transcription, la réplication et la recombinaison spécifique à un site. On suppose que le chromosome bactérien est constitué de 40 à 50 domaines super-enroulés avec 25 super-enroulements pour 1 kb. ADN. Actuellement, il n'existe pas de données précises sur l'état topologique oric nécessaire pour initier la réplication dans E. coli. On sait que les mutations du gène de la topoisomérase hautA supprimer les mutations sensibles à la température ADNA(Ts). On suppose que dans ces souches mutantes, la topologie oric modifié de telle manière qu’il permet l’initiation de la réplication à des concentrations intracellulaires plus faibles de la protéine DnaA. De plus, l'importance d'un certain état topologique oric car l'initiation indique une violation de l'initiation chez les bactéries mutantes avec un gène altéré gyrB(Ts), codant pour la sous-unité B de l'ADN gyrase.

Activation de la réplication par transcription. Dans le cas où le superenroulement de minichromosomes ou de plasmides contenant oric, est insuffisant pour initier leur réplication, l'initiation peut se produire avec transcription simultanée de l'ADN à proximité oric. Changer la topologie oric Dans ce cas, cela peut être réalisé à travers la formation Boucles R(hybride ADN-ARN dans l'ADN double brin) ou en raison de la transcription, en tant que telle, dans laquelle un super-enroulement positif local de l'ADN a lieu avant l'ARN polymérase de transcription, suivi d'un super-enroulement négatif. Cela facilite la formation de complexes ouverts lors du lancement de la synthèse de l'ADN.

^ Rôle des protéinesADNAdans la régulation de l’initiation de la réplication. Environ 60 minutes sont nécessaires aux bactéries pour répliquer l’ADN chromosomique, séparer les chromosomes filles et se préparer à une nouvelle division. Par conséquent, les cellules dont la durée de génération est inférieure à cette période (par exemple, à des températures élevées sur un milieu nutritif riche) doivent initier la réplication des chromosomes destinés aux divisions ultérieures avant la fin du cycle de réplication précédent. Ainsi, une seule cellule peut contenir un chromosome en réplication avec plusieurs origines de réplication. Dans ce cas, l'initiation de la réplication sur plusieurs zones du début de la réplication se produit simultanément.

La surproduction de DnaA dans les bactéries entraîne une forte augmentation de la fréquence des initiations de réplication sans modifier le taux global de synthèse de l'ADN, ce qui indique que le DnaA est un régulateur positif de ce processus. Parmi les modèles expliquant le mécanisme de l'action régulatrice de la protéine DnaA, le modèle de titrage DnaA est le plus utilisé. Conformément à ce modèle, la totalité de la protéine DnaA nouvellement synthétisée est liée (titrée) par des boîtes DnaA. oric chromosomes. Dès que le nombre de molécules initiatrices dépasse le nombre de cases DnaA intracellulaires (toutes les cases DnaA sont occupées par la protéine), la synthèse d’ADN est initiée. Après avoir commencé l'initiation sur un oric il y a une libération de molécules d'ADNA, une forte augmentation de sa concentration intracellulaire et une initiation synchrone de la synthèse d'ADN au niveau d'autres régions accessibles de l'origine de la réplication. Parallèlement, association avec les membranes du premier oric le protège de son utilisation lors de la réinitiation.

Le rôle de la Dam-méthylation dans l'initiation de la synthèse de l'ADN. Comme mentionné ci-dessus, la méthyltransférase de E. coli Dam modifie les résidus adénine dans les séquences 5'-GATC. À la suite de la réplication, la molécule d'ADN passe temporairement d'une molécule entièrement méthylée à une molécule méthylée le long d'un brin, ce qui permet à la cellule de reconnaître de nouvelles molécules. ADN synthétisé. oric Enterobacteriaceae est très conservatrice (voir Fig. I.47, UN). L'ADN plasmidique non méthylé ou semi-méthylé ne se réplique pas dans les cellules mères mutantes, bien qu'il serve de substrat dans le système de réplication acellulaire. La réplication de l'ADN chromosomique chez les mutants maternels commence à oric, cependant, le contrôle de la réplication est rompu, ce qui se manifeste par l'asynchronisme de la réplication sur plusieurs oric. Il s'est avéré que seulement à moitié méthylé, mais pas entièrement méthylé ou non méthylé oric- L'ADN se lie spécifiquement à une fraction des membranes d'E. coli in vitro. Dans le même temps, dans les cellules à croissance rapide, 1/3 du temps de génération oric- L’ADN est à moitié méthylé, après quoi il est entièrement méthylé. Il en va de même pour le promoteur du gène initiateur DnaA, dans lequel l'état semi-méthylé est associé à la suppression de la transcription du gène. En revanche, la reméthylation du brin d'ADN nouvellement synthétisé du reste du chromosome bactérien se produit rapidement, en 1 à 2 minutes. Sur la base de ce type de données, il est suggéré que dans l'état incomplètement méthylé, les séquences ci-dessus sont protégées par les membranes bactériennes des contacts avec les protéines régulatrices et ne peuvent pas participer au cycle répété d'initiation de la réplication (période éclipse). Mutations dans un gène séqA réduire considérablement le temps d'éclipse, qui se manifeste par l'asynchronie des initiations de réplication. La protéine SeqA s'est avérée être un régulateur négatif de l'initiation de la réplication, agissant au stade de l'interaction oric avec des membranes bactériennes.

^ Le rôle de la protéine SeqA dans la régulation de la réplication des chromosomes bactériens. Gène séqA code pour une protéine d'une longueur de 181 résidus d'acides aminés, dont l'inactivation est mortelle pour les cellules bactériennes. L'étude de l'interaction de cette protéine avec des régions non méthylées, partiellement et totalement méthylées de l'origine de réplication par la méthode de déplacement de bande lors de l'électrophorèse en gel de Polyacrylamide a montré sa liaison préférentielle aux séquences partiellement méthylées. Cependant, pour que son interaction soit pleinement spécifique (dépendante du contexte), la présence de facteurs supplémentaires est requise. En effet, dans la composition des complexes ADN-protéine formés avec la participation de séquences partiellement méthylées oric, une protéine d'un poids moléculaire de 24 kDa a été trouvée qui interagit spécifiquement avec le brin d'ADN méthylé dans oric. Le criblage de la banque de clones de séquences d'E. coli a permis de cloner le gène hobH (liaison d'origine hémiméthylée) codant pour cette protéine. Les mutations de ce gène ont entraîné une perte partielle de synchronisation dans les cellules bactériennes lors des initiations de réplication, ce qui indique également indirectement l'implication de la protéine HobH dans la régulation de l'initiation de la réplication des chromosomes bactériens aux premiers stades du cycle cellulaire. Cependant, le véritable rôle de cette protéine dans la réplication n’est pas entièrement connu.

La période d'éclipse peut se terminer suite à l'achèvement progressif de la méthylation d'une séquence partiellement méthylée. oric en association avec des membranes. La méthylation complète de ces séquences empêche leur interaction avec les membranes et les rend disponibles à l'initiateur DnaA.

^ arrêt de la réplication. La rencontre de deux fourches de réplication à la fin du cycle de réplication des chromosomes bactériens s'accompagne de plusieurs événements nécessaires à la séparation complète des deux chromosomes bactériens résultants avant la division cellulaire. Le mouvement des fourches de réplication les unes vers les autres s'accompagne d'une recombinaison homologue entre chromatides filles. Dans le cas où le nombre de recombinaisons survenues est impair, un dimère du chromosome bactérien se forme, tandis qu'avec un nombre pair de recombinaisons, deux chromosomes caténés (liés l'un à l'autre) se forment. Dans le second cas, la séparation des caténanes par la topoisomérase IV conduit à une séparation complète des chromosomes filles, alors que cela n'est pas suffisant dans le cas du dimère chromosomique bactérien. La séparation du dimère pour former des monomères se produit à la suite d'une recombinaison spécifique au site au locus. dif sous l'action de la résolvase (recombinase spécifique au site) XerCD.
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4.2.2 Régulation de la réplication du plasmide ColE1

De nombreuses cellules procaryotes contiennent, en plus du chromosome principal, un petit ADN extrachromosomique appelé plasmides. Les plasmides, dont la taille varie de plusieurs milliers à des centaines de milliers de paires de bases et le nombre de copies par cellule - de une à plusieurs centaines, sont capables de réplication autonome (indépendante du chromosome principal) et sont hérités de manière stable dans un certain nombre de générations de cellules. Bien que de nombreux plasmides confèrent aux cellules hôtes des avantages sélectifs tangibles (résistance aux antibiotiques, aux métaux lourds, etc.), la plupart d'entre eux sont énigmatique, c'est à dire. ne se manifeste pas dans le phénotype visible des cellules. Étant donné que leur existence représente une charge importante sur le métabolisme des cellules hôtes, la signification de leur stabilité évolutive reste floue. Malgré le fait que dans des conditions naturelles, les cellules bactériennes ne semblent pas subir de pression de sélection visant à maintenir les plasmides à l'intérieur des cellules, ces dernières se séparent de manière stable entre les cellules bactériennes filles à l'aide de mécanismes subtils qui régulent le nombre de copies de leurs copies dans les cellules.

L'origine de réplication du petit plasmide ColE1 portant des gènes de résistance à la colicine est traditionnellement utilisée en génie génétique pour la construction de molécules d'ADN vectorielles utilisées pour le clonage et l'expression de courtes séquences nucléotidiques dans les cellules d'E. coli. C'est pourquoi il est opportun de considérer les mécanismes de contrôle de la réplication du plasmide ColE1.

^ Initiation de la réplication du plasmide ColE1. La réplication du plasmide ColE1 se produit dans une direction (réplication unidirectionnelle) à l'aide de l'appareil de réplication de la cellule hôte. À lui seul, le plasmide ne code pour aucune des enzymes nécessaires à sa réplication. L'origine de réplication contient deux promoteurs, dont l'un assure la synthèse de l'amorce ARN (ARN II) nécessaire pour initier la réplication plasmidique. L'ARN II synthétisé, dont la longueur dépend du type de plasmide répliqué, est ensuite traité par la RNase H pour former un ARN de 550 nucléotides de longueur. Cette molécule est utilisée efficacement par l'ADN polymérase I comme amorce dans la synthèse du brin d'ADN principal. En l'absence de RNase H, l'extrémité 3' de l'ARN II sert d'amorce lors de la réplication, bien qu'avec moins d'efficacité. Dans les cellules défectueuses en RNase H et en ADN polymérase, la réplication ColE1 est initiée par l'ADN polymérase III avec la participation de l'ARN II selon le mécanisme discuté en détail ci-dessus.

Les trois mécanismes d'initiation de la réplication plasmidique sont basés sur la propriété unique de l'ARN II de former un hybride ADN-ARN stable à l'origine de la réplication. En effet, les transcrits normaux sont libérés du complexe de transcription une fois la transcription terminée et l'ARN polymérase est séparée de la matrice, ce qui n'est pas le cas de l'ARN II. L'analyse des mutants plasmidiques défectifs pour la réplication, ainsi que de leurs révertants, a montré que dans l'hybride ARN II stable avec la matrice, une interaction se produit entre la boucle riche en G de l'ARN II, formée 265 nucléotides en amont du point d'initiation de la réplication (position – 265), et l'ADN de la région riche en C située à proximité du nucléotide -20 (Fig. I.48, UN). Ces deux séquences ont été conservées dans les plasmides apparentés pMB1, p15A et KSF1030. Les interactions entre ces séquences semblent se produire au moment où l'ARN polymérase est encore dans le complexe de transcription et où les chaînes d'ADN à proximité du complexe sont détordues. L'équilibre entre les deux conformations alternatives de l'ARN II est essentiel pour déterminer la proportion de molécules d'ARN restant dans l'hybride ADN-ARN nécessaire pour initier la réplication plasmidique. Le choix entre deux conformations alternatives de l'ARN II est déterminé par la structure primaire de la région située entre les nucléotides –359 et –380 (séquence ) (voir Fig. I.48, b). Cette séquence peut interagir avec la séquence complémentaire  située au dessus (structure ) ou avec la séquence homologue  située en dessous (structure ). Une fois que l'ARN polymérase a transcrit les 200 premiers nucléotides, l'ARN II résultant forme une structure secondaire temporaire caractérisée par la présence de trois domaines tige-boucle (I, II et III). L'extension de l'ARN II par quelques nucléotides supplémentaires conduit à la destruction de la tige III et à la formation de la tige IV, qui est stabilisée grâce aux interactions complémentaires entre les séquences  et . Lors de l’élongation ultérieure de l’ARN II, il dispose de deux possibilités alternatives pour former sa structure secondaire. Le choix en faveur de l'une ou l'autre conformation dépend du fait que la séquence  reste associée à la séquence  ou qu'elle forme de nouveaux contacts avec la séquence . La transition des paires complémentaires  à  s'accompagne de forts changements dans la conformation de l'ARN II, qui déterminent finalement sa capacité à servir d'amorce lors de la réplication plasmidique. Les molécules d’ARN II dans la conformation  peuvent former un hybride ARN-ADN qui sert de substrat à la RNase H, alors que dans la conformation , elles n’ont pas cette capacité. Le modèle proposé est principalement soutenu par le fait que les mutations favorisant la formation de la conformation  dues à la déstabilisation de la tige IV entravent le fonctionnement de l'ARN II en tant qu'amorce et conduisent à une diminution du nombre de copies du plasmide ColE1 à l'intérieur des cellules bactériennes. . Ces plasmides mutants déficients en réplication sont activés par des mutations suppressives qui stabilisent la tige IV. Ainsi, l'initiation de la réplication du plasmide ColE1 dépend de la capacité de l'ARN II à former un hybride ARN-ADN à proximité de l'origine de réplication (ori). Dans ce cas, la formation de l'hybride est influencée par les structures secondaires et tertiaires situées au-dessus de la séquence nucléotidique du précurseur de l'amorce.

^ Riz. I.48. Schéma de régulation de la réplication du plasmide ColE1

UN– structure secondaire putative de l'ARN II, après transcription par l'ARN polymérase  500 nucléotides de l'ADN plasmidique ; l'élongation supplémentaire de l'ARN II s'accompagne de la formation d'un hybride ADN-ARN (flèche en gras) entre l'ARN II et l'ADN transcrit ;

b est un mécanisme possible pour contrôler la réplication plasmidique. La partie supérieure de la figure montre une carte génétique de la région d'ADN requise pour initier et contrôler la réplication de l'ADN plasmidique. Les structures spatiales de deux inhibiteurs de la réplication plasmidique : l'ARN I et la protéine Rop sont présentées schématiquement. La partie inférieure montre deux conformations alternatives de l'ARN II, formées sous l'action de l'ARN I, I-X sont des éléments de la structure secondaire
^ Contrôle du nombre de copies du plasmide ColE1. Le contrôle de l'initiation de la réplication du plasmide ColE1 s'effectue principalement au niveau des modifications de la structure spatiale de l'ARN II. Puisque les plasmides contrôlent leur propre biosynthèse, c'est-à-dire leur réplication se déroule par un mécanisme autocatalytique, il a été postulé que l'initiation de la réplication de ColE1 se fait sous l'influence d'un inhibiteur codé par le plasmide, dont la concentration dans la cellule est d'autant plus élevée que le nombre de copies intracellulaires du plasmide est important. . En effet, l'analyse des mécanismes de réplication des plasmides mutants, caractérisés par un nombre de copies élevé, a permis d'identifier deux transe- agissant sur des facteurs codés par le plasmide et influençant la réplication du plasmide in vivo.

Le principal inhibiteur de la réplication était un petit ARN de 108 nucléotides de long, appelé ARN I, entièrement complémentaire de la séquence 5'-terminale du précurseur de l'amorce (ARN II). Le promoteur du gène ARN I est situé dans la région de l'origine de réplication du plasmide ColE1 et est dirigé dans la direction opposée par rapport au promoteur ARN II (voir Fig. I.48). Les interactions complémentaires entre l'ARN I et l'ARN II influencent la formation de la structure spatiale de l'ARN II de telle manière que la conformation βγ apparaît préférentiellement, qui est inactive par rapport à l'initiation de la réplication (voir Fig. I.48, b, en bas à droite).

L'interaction entre l'ARN I et l'ARN II ne se produit de manière productive que tant qu'un court transcrit d'ARN II ne dépassant pas 80 nucléotides est synthétisé. Bien que l'interaction de l'ARN I avec une séquence de nucléotides aussi courte soit plus lente qu'avec un transcrit de 360 nucléotides, dans ce dernier cas, l'ARN I n'affecte pas la conformation de la partie 5'-terminale de l'ARN II et sa capacité pour fonctionner comme une amorce dans la réplication plasmidique (conformation αβ, Fig. I.48, b, en bas à gauche). Il en ressort clairement que le taux de formation d'hybrides entre l'ARN I et l'ARN II est déterminant pour le fonctionnement efficace du mécanisme de régulation de la réplication plasmidique. Le processus d’interaction entre l’ARN I et l’ARN II a maintenant été étudié en détail. Il passe par la formation de plusieurs intermédiaires et aboutit à un hybride stable entre l'ARN I entièrement complémentaire et la région 5'-terminale de l'ARN II.

^ Protéine organisatrice d'ARN Rop. Le gène du deuxième composant, qui régule négativement la réplication du plasmide ColE1, est cartographié directement derrière l'origine de la réplication. Ce gène code pour une protéine de 63 pb appelée Rop (répresseur d'amorce) qui existe en solution sous forme de dimère. Tant in vivo qu'in vitro, Rop améliore l'activité inhibitrice de l'ARN I sans affecter la synthèse de l'ARN II. Dans le même temps, Rop affecte les phases initiales de l’interaction entre l’ARN I et l’ARN II, facilitant la transition d’un intermédiaire C* très instable vers un intermédiaire plus stable, C m*. La protéine Rop a une forte affinité pour C* et n’interagit que faiblement avec l’ARN I et l’ARN II isolés in vitro. On suppose que Rop présente peu de spécificité en ce qui concerne les séquences nucléotidiques et reconnaît certaines caractéristiques communes de la structure du complexe ARN I – ARN II qui se produisent aux premiers stades de leur interaction. Ainsi, les fonctions de la protéine Rop consistent apparemment dans la transformation d'un complexe ARN-ARN instable en un complexe plus stable, ce qui, à son tour, s'accompagne de la suppression de la formation de l'amorce nécessaire pour initier la réplication du Plasmide ColE1.

L'utilisation d'ARN antisens dans le contrôle de la réplication des plasmides bactériens est une technique courante. En particulier, la réplication du petit plasmide R1 à faible nombre de copies est contrôlée par la protéine RepA, qui est impliquée dans l'initiation de la réplication plasmidique en tant que facteur de régulation positif. La synthèse de RepA, à son tour, est régulée post-transcriptionnellement par le petit ARN antisens CopA, qui se lie à l'ARNm de RepA dans une réaction en plusieurs étapes rappelant la fusion ARN I/ARN II évoquée ci-dessus. Cette interaction supprime l'expression des gènes. repa, probablement en raison du clivage du duplex ARN-ARN par la RNase III. La concentration intracellulaire d’ARN CopA antisens est directement proportionnelle au nombre de copies du plasmide R1. Un mécanisme similaire a été décrit pour la régulation de l'initiation de la réplication du plasmide Staphylococcus aureus pT181.

Lors de l'obtention de vecteurs bactériens pour le génie génétique, dont beaucoup contiennent l'origine de réplication du plasmide ColE1, des inhibiteurs de la biosynthèse des protéines, notamment le chloramphénicol, sont souvent utilisés pour augmenter leur nombre de copies dans les cellules bactériennes. Après avoir discuté des mécanismes de régulation du contrôle de la réplication de ce plasmide, les principes sur lesquels repose cette technique deviennent clairs. En effet, l'introduction de chloramphénicol dans le milieu de culture bloque la biosynthèse des protéines bactériennes, dont la protéine Rop, nécessaire pour supprimer efficacement l'initiation de la réplication plasmidique sous l'action de l'ARN I. Des protéines bactériennes pré-synthétisées à cet effet.

On sait que deux plasmides phénotypiquement différents utilisant le même mécanisme de contrôle de la réplication sont incompatibles dans la même cellule bactérienne. Les cellules contenant deux plasmides de groupes de compatibilité différents forment rapidement deux populations lors de la propagation, chacune ne contenant qu'un seul type de plasmide. Cela est dû à la sélection aléatoire de plasmides pour la réplication dans les cellules bactériennes et à la distribution aléatoire du pool initial de plasmides aux cellules filles. L'émergence évolutive d'un mécanisme de contrôle de la réplication des plasmides bactériens à l'aide d'ARN antisens a élargi les possibilités d'émergence de plasmides appartenant à différents groupes de compatibilité et coexistant dans les mêmes cellules bactériennes. En effet, malgré l’utilisation du même mécanisme, les ARN antisens ayant des séquences nucléotidiques différentes ne seront pas capables de reconnaître les ARN cibles hétérologues « étrangers ». Cela permet à ces plasmides de coexister dans une cellule bactérienne et crée les conditions d'une distribution plus large dans les populations naturelles de micro-organismes.

Réplication de l'ADN

Réplication de l'ADN- le processus de synthèse de la molécule fille de l'acide désoxyribonucléique sur la matrice de la molécule d'ADN parent. Lors de la division ultérieure de la cellule mère, chaque cellule fille reçoit une copie d'une molécule d'ADN identique à l'ADN de la cellule mère d'origine. Ce processus garantit la transmission précise des informations génétiques de génération en génération. La réplication de l'ADN est réalisée par un complexe enzymatique complexe composé de 15 à 20 protéines différentes, appelées anglaises. réplique) .

Histoire des études

Chaque molécule d'ADN est constituée d'un brin de la molécule mère d'origine et d'un brin nouvellement synthétisé. Un tel mécanisme de réplication est appelé semi-conservateur. À l'heure actuelle, ce mécanisme est considéré comme prouvé grâce aux expériences de Matthew Meselson et Franklin Stahl (d.). Auparavant, il existait deux autres modèles : « conservateur » - à la suite de la réplication, une molécule d'ADN est formée, constituée uniquement de chaînes parentales, et une, constituée uniquement de chaînes enfants ; "dispersif" - toutes les molécules d'ADN résultant de la réplication sont constituées de chaînes dont certaines sections sont nouvellement synthétisées, tandis que d'autres sont extraites de la molécule d'ADN mère.

Représentations générales

La réplication de l'ADN est un événement clé au cours de la division cellulaire. Il est important qu’au moment de la division, l’ADN soit complètement répliqué et une seule fois. Ceci est assuré par certains mécanismes de régulation de la réplication de l'ADN. La réplication s'effectue en trois étapes :

lancement de la réplication
élongation
fin de la réplication.

La réplication est régulée principalement au stade de l'initiation. C'est assez simple à faire, car la réplication peut commencer non pas à partir de n'importe quel segment d'ADN, mais à partir d'un segment strictement défini, appelé site d'initiation de la réplication. Dans le génome, il peut y avoir un seul ou plusieurs sites de ce type. Le concept de site d'initiation de réplication est étroitement lié au concept réplicon . Un réplicon est une portion d'ADN qui contient un site d'initiation de la réplication et qui se réplique après le début de la synthèse de l'ADN à partir de ce site. Les génomes bactériens sont généralement constitués d’un seul réplicon, ce qui signifie que la réplication du génome entier est le résultat d’un seul acte d’initiation de la réplication. Les génomes eucaryotes (ainsi que leurs chromosomes individuels) sont constitués d'un grand nombre de réplicons indépendants, ce qui réduit considérablement le temps total de réplication d'un chromosome individuel. Les mécanismes moléculaires qui contrôlent le nombre d'initiations de réplication sur chaque site par cycle de division cellulaire sont appelés contrôle du nombre de copies. En plus de l'ADN chromosomique, les cellules bactériennes contiennent souvent des plasmides, qui sont des réplicons individuels. Les plasmides ont leurs propres mécanismes de contrôle de copie : ils peuvent assurer la synthèse d'une seule copie du plasmide par cycle cellulaire, et de milliers de copies.

La réplication commence au site d'initiation de la réplication avec le déroulement de la double hélice d'ADN, formant fourche de réplication est le site de réplication directe de l’ADN. Chaque site peut former un ou deux forks de réplication, selon que la réplication est unidirectionnelle ou bidirectionnelle. La réplication bidirectionnelle est plus courante. Quelque temps après le début de la réplication, on peut observer au microscope électronique oeil de réplication - une région du chromosome où l'ADN a déjà été répliqué, entourée de régions plus longues d'ADN non répliqué.

Au niveau de la fourche de réplication, l'ADN copie un grand complexe protéique (réplisome), dont l'enzyme clé est l'ADN polymérase. La fourche de réplication se déplace à une vitesse d'environ 100 000 paires de bases par minute chez les procaryotes et de 500 à 5 000 chez les eucaryotes.

Mécanisme moléculaire de réplication

Les enzymes (hélicase, topoisomérase) et les protéines liant l'ADN déroulent l'ADN, maintiennent la matrice dans un état dilué et font tourner la molécule d'ADN. L'exactitude de la réplication est assurée par la correspondance exacte des paires de bases complémentaires et l'activité de l'ADN polymérase, capable de reconnaître et de corriger l'erreur. La réplication chez les eucaryotes est réalisée par plusieurs ADN polymérases différentes. Ensuite, les molécules synthétisées sont tordues selon le principe du superenroulement et du compactage ultérieur de l'ADN. La synthèse est gourmande en énergie.

Les chaînes de la molécule d'ADN divergent, forment une fourche de réplication et chacune d'elles devient une matrice sur laquelle une nouvelle chaîne complémentaire est synthétisée. En conséquence, deux nouvelles molécules d’ADN double brin sont formées, identiques à la molécule mère.

Caractéristiques du processus de réplication

Remarques

Littérature

Préservation de l'ADN sur plusieurs générations : réplication de l'ADN (Favorova O.O., SOZH, 1996)PDF (151 Ko)
Réplication de l'ADN (animation) (anglais)

Fondation Wikimédia. 2010 .

Réplicant (BeOS)
Repnikha

Voyez ce qu'est « Réplication de l'ADN » dans d'autres dictionnaires :

Réplication de l'ADN- - biosynthèse de nouvel ADN sur la matrice de l'ADN maternel... Dictionnaire concis de termes biochimiques

Réplication de l'ADN- DNR biosintezė statusas T sritis chemija apibrėžtis Fermentų katalizuojama polinukleotidinė DNR sintezė ant DNR matricos. atitikmenys : engl. Russie de réplication de l'ADN. Méthodes de réplication de l'ADN : sinonimas - Réplication DNR ... Chemijos terminų aiskinamasis žodynas

RÉPLICATION- (du latin tardif réplicatio répétition), reduplication, auto-réplication, processus d'auto-reproduction de macromolécules d'acides nucléiques en t, fournissant une copie précise du génétique. l'information et sa transmission de génération en génération. Au cœur du mécanisme de R. ... ... Dictionnaire encyclopédique biologique

RÉPLICATION- (du latin tardif réplicatio répétition) (autoreproduction, autosynthèse, reduplication), doublement des molécules d'ADN (dans certains virus à ARN) avec la participation d'enzymes spéciales. La réplication est également appelée doublement des chromosomes, qui est basée sur la réplication... Grand dictionnaire encyclopédique

ADN- (acide désoxyribonucléique), ACIDE NUCLÉIQUE, qui est le composant principal du CHROMOSOME des cellules EUCARYOTES et de certains VIRUS. L'ADN est souvent appelé la « pierre angulaire » de la vie car il contient le CODE GÉNÉTIQUE,... ... Dictionnaire encyclopédique scientifique et technique

Réplication non gérée- * réplication incontrôlée réplication multiple de l'ADN plasmidique, qui n'est pas associée à la division cellulaire et n'est pas contrôlée par cette division... La génétique. Dictionnaire encyclopédique

ADN- ADN double hélice L'acide désoxyribonucléique (ADN) est l'un des deux types d'acides nucléiques qui assurent le stockage, la transmission de génération en génération et la mise en œuvre du programme génétique pour le développement et le fonctionnement des organismes vivants. Principal ... ... Wikipédia

Réplication (biologie)

Réplication (cytologie)- Représentation schématique du processus de réplication, les nombres indiquent : (1) brin en retard, (2) brin avant, (3) ADN polymérase (Polα), (4) ADN ligase, (5) amorce d'ARN, (6) ADN primase, (7 ) Fragment d'Okazaki, (8) ADN polymérase (Polδ), (9) ... ... Wikipédia

Spivak Irina Mikhaïlovna

Réplication de l'ADN

Introduction

Le programme génétique de tous les organismes vivants, à l'exception des virus à ARN, est écrit dans la séquence nucléotidique de l'ADN. Par conséquent, pour préserver les propriétés uniques de l’organisme, il est nécessaire de reproduire avec précision cette séquence à chaque génération suivante. E. coli, par exemple, doit dupliquer un génome complet de 4 x 10 6 paires de bases presque sans erreur dans la formation de chaque génération successive ; de la même manière, près de 4 x 10 9 paires de bases doivent être copiées dans 23 paires de chromosomes humains lors de chaque division cellulaire. La principale propriété de l’ADN est qu’il sert de modèle et détermine l’ordre dans lequel les nucléotides s’alignent en nouveaux brins polynucléotidiques.

En fait, la réplication de l’ADN au sens large est un processus très important pour une cellule en division. Cela comprend également la préparation de la chromatine pour la réplication et la prévention des mitoses répétées. Cela garantit une seule duplication de l’ADN au cours d’un cycle cellulaire, maintenant ainsi la stabilité du génome.

La stabilité génétique des organismes vivants est largement déterminée par le fonctionnement du complexe de protéines qui assurent la réplication de l'ADN. De toute évidence, la réplication de l’ADN est régulée par diverses interactions protéine-protéine et ADN-protéine, dont le mécanisme reste inconnu. De plus, le complexe de réplication de l’ADN fonctionne de concert avec des complexes protéiques qui réparent les dommages causés à l’ADN. Dans le même temps, le processus de transfert d’informations de l’organisme parent à l’enfant s’accompagne de la recombinaison de molécules d’ADN pour créer une plus grande diversité héréditaire. Le processus de recombinaison de l'ADN est décrit en détail lors du croisement méiotique lors de la formation des cellules germinales, lors de la recombinaison V(D)J - le processus de formation de divers gènes d'immunoglobulines et de récepteurs d'immunoglobulines, sous l'action de certains systèmes de réparation de l'ADN. Compte tenu de toute la diversité et de la cohérence des processus du métabolisme de l'ADN, on peut supposer une diversité encore plus grande et une interaction complexe de complexes protéiques qui assurent une reproduction stable du matériel héréditaire au fil des générations.

Il est important de réaliser que l’ADN code des informations sur le mécanisme de sa propre duplication : certains gènes codent pour des enzymes qui synthétisent les précurseurs nucléotidiques de l’ADN, tandis que d’autres codent pour des protéines qui assemblent les nucléotides activés en chaînes polynucléotidiques. Il existe des gènes qui coordonnent le processus de réplication avec d’autres événements cellulaires, ainsi que des gènes qui codent pour des protéines qui conditionnent l’ADN dans la chromatine.

Comprendre la régulation et la dynamique de ces systèmes constitue un défi majeur pour la biologie moléculaire du 21e siècle.

Chapitre 1. Réplication - réaction polymérase

En publiant leur modèle de la structure de l'ADN en 1953, James Watson et Francis Crick écrivaient : « Nous ne pouvions nous empêcher de réaliser que l'appariement de bases spécifique que nous postulions implique un mécanisme permettant de copier du matériel théiste. » Ils ont été les premiers à noter : « Si vous connaissez l’ordre exact des bases dans l’une des chaînes, alors vous pouvez noter l’ordre des bases dans l’autre, puisque l’appariement des bases est spécifique. Ainsi, un volet est le complément de l’autre ; c’est cette propriété qui suggère que l’ADN peut se dupliquer.

Watson et Crick ont suggéré que pour que l'ADN se duplique, les liaisons hydrogène qui maintiennent le duplex hélicoïdal ensemble doivent être rompues et les brins séparés. Ils ont également suggéré que chaque brin duplex sert de modèle dans la synthèse d'un brin complémentaire et que, par conséquent, deux paires de brins sont formées, chacune n'ayant qu'un seul parent. C’est le mécanisme permettant de reproduire avec précision la séquence des paires de nucléotides dans la double hélice de l’ADN. Watson et Crick pensaient que la réplication de l'ADN s'effectuait spontanément, sans la participation d'enzymes, mais cela s'est avéré incorrect. Cependant, l’idée selon laquelle la duplication de l’ADN se produit en connectant des nucléotides en série selon la règle de complémentarité donnée par chaque brin de l’hélice a résolu le problème conceptuel de la reproduction précise des gènes.

Selon le modèle généralement accepté, la réplication de tout ADN double brin est semi-conservatrice. On ne sait pas s’il existe d’autres moyens de répliquer l’ADN double brin dans la nature (par exemple conservé ou dispersé). Ainsi, après chaque événement de réplication, un brin dans les deux molécules filles est le parent, conservateur, et l'autre est la fille nouvellement synthétisée. C'est ce mécanisme de copie qui est appelé semi-conservateur. Si le génome est représenté par de l'ADN simple brin (comme dans certains virus), alors ce simple brin sert de modèle pour la formation d'un brin complémentaire avec lequel il forme un duplex, puis soit des duplex enfants, soit des copies simple brin de l'un des brins de la matrice est synthétisé sur ce duplex.

Watson et Crick, déjà dans leur deuxième travail en 1953, suggéraient un mécanisme possible pour copier le matériel héréditaire. Il est facile d’imaginer que les chaînes d’une molécule d’ADN divergent et que chacune d’elles devient un gabarit sur lequel une nouvelle chaîne complémentaire est synthétisée. En conséquence, deux molécules d’ADN double brin filles sont formées, impossibles à distinguer de la molécule mère.

En 1957, A. Kornberg découvre chez les bactéries E. coli une enzyme qui catalyse le processus de polymérisation de l'ADN à partir des nucléotides - l'ADN polymérase 1. En 1959, Arthur Kornberg (A. Kornberg) a reçu le prix Nobel pour avoir découvert le mécanisme de biosynthèse de l'ADN. Il a montré que le doublement des molécules d’ADN repose sur des réactions biochimiques ordinaires.

De manière générale, la réaction d'addition du groupe 5'-désoxynucléotide au groupe 3'-OH du nucléotide terminal de la chaîne d'amorce peut être représentée comme suit :

N + dNTP<->n+1 + PPje

où dNMP est l’un des quatre nucléotides communs. Au cours d'un acte de réplication, le brin contenant l'extrémité 3' est prolongé par un résidu nucléotidique, tandis que le pyrophosphate est éliminé simultanément. La réaction d'addition de nucléotides est réversible, mais comme le phosphate inorganique dans les cellules est rapidement détruit, la réaction est activement dirigée vers la synthèse. La réplication de l'ADN s'effectue toujours de l'extrémité 5' du brin d'ADN (c'est-à-dire contenant le groupe désoxynucléotide 5') jusqu'à l'extrémité 3' (c'est-à-dire contenant le groupe 3-OH libre) et nécessite la présence d'un ADN préalablement synthétisé. fragment de brin comme amorce pour la réaction de polymérisation. Un tel fragment d'ADN ayant une extrémité 3' libre est appelé une amorce. Les enzymes qui catalysent la réaction d'addition de désoxynucléotides dépendante de l'amorce et déterminée par la matrice sont appelées ADN polymérases. À ce jour, plusieurs classes différentes d’ADN polymérases ont été isolées et caractérisées, et les propriétés de ces enzymes et les réactions qu’elles catalysent ont été décrites en détail. Nous parlerons en détail de leur structure et de leurs caractéristiques individuelles dans les chapitres suivants.

1.1. Fourche de réplication

Le processus de réplication se déroule dans des structures spéciales appelées forks de réplication. L'agencement schématique de la fourche de réplication d'E. coli est illustré à la Fig. 1. Le fait que deux brins d'une molécule d'ADN soient situés de manière antiparallèle l'un par rapport à l'autre crée un certain nombre de problèmes pour leur réplication multidirectionnelle simultanée.

Au fur et à mesure que la fourchette se déplace, deux brins enfants doivent être synthétisés simultanément. La fourchette se déplace dans la direction de 5 " à 3' sur une chaîne et de 3 ’ Cependant, les acides nucléiques ne sont synthétisés que de l'extrémité 5" à l'extrémité 3". Le problème est résolu de telle manière que sur l'un des brins parents, un nouveau brin est synthétisé en continu dans l'extrémité 5"- 3", qui coïncide avec le mouvement de la réplication de la fourche. C'est ce qu'on appelle l'avance ou l'avance. L'autre brin est appelé en retard ou en retard, car la synthèse sur celui-ci se produit avec un certain retard par rapport au brin principal. Cela est dû à la le fait que l'ADN sur ce brin est également synthétisé de 5 "à 3", mais dans le sens opposé au mouvement de la fourche, et des fragments courts. De ce fait, la synthèse multidirectionnelle d'ADN peut être réalisée dans le cadre d'une seule structure - la fourchette de réplication.

Riz. 1. Schéma du fork de réplication.

La longueur de ces fragments courts chez les procaryotes est de 1 000 à 2 000 pb. Ils étaient appelés « fragments d'Okazaki » en l'honneur du scientifique qui les a découverts. Au fur et à mesure que la fourche de réplication se déplace, les extrémités des fragments d'Okazaki adjacents se rejoignent pour former un brin en retard continu. Pour que le processus se déroule de manière synchrone sur les deux threads, les complexes polymérases des threads principaux et retardés sont interconnectés, formant une structure tridimensionnelle complexe (Fig. 1, b)

La branche de réplication peut se déplacer soit dans un sens à partir du point de départ de la réplication, soit dans les deux sens. En fonction de cela, le processus est appelé réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle. Ce à quoi cela ressemble schématiquement est montré sur la Fig. 2. Chez les eucaryotes, la réplication est généralement bidirectionnelle. Également à E. coli.

Les mécanismes d'initiation de la réplication à l'origine de la réplication et de formation de fragments d'Okazaki dans le brin en retard sont fondamentalement similaires, bien qu'il existe quelques différences subtiles. Dans les deux cas, de courtes amorces d’ARN se forment. ( amorces ), ADN matrice complémentaire, sous la forme d'une continuation de laquelle un nouveau brin d'ADN est synthétisé. Par la suite, les courts inserts d'ARN sont remplacés par des segments d'ADN, les fragments individuels d'Okazaki sont ensuite combinés pour former un brin retardé continu.

Tous les organismes vivants sur Terre sont généralement divisés en procaryotes et eucaryotes (du grec karyon - le noyau). La principale caractéristique des procaryotes est l'absence, contrairement aux eucaryotes, d'un noyau cellulaire à part entière recouvert d'une membrane. Le matériel génétique des procaryotes est localisé dans le nucléoïde, l'équivalent primitif du noyau eucaryote. Les cellules procaryotes sont très petites – environ 1 micron. Le volume des cellules eucaryotes est 800 à 1 000 fois supérieur à celui des cellules procaryotes. Les procaryotes comprennent les bactéries et les archées (ou archéobactéries), dont les ancêtres sont apparus il y a environ 4 milliards d'années. Les eucaryotes peuvent être unicellulaires ou multicellulaires. Ils sont apparus sur Terre environ 500 millions d'années après les procaryotes.

Selon les concepts modernes, le métabolisme de l’ADN chez les procaryotes présente certaines différences par rapport à celui des eucaryotes. En décrivant les processus de réplication et de recombinaison, nous soulignerons à chaque fois ces différences.

Chapitre 2 Démarrage de la réplication

La réplication de l'ADN ne commence pas à un point aléatoire de la molécule, mais à des endroits spécifiques appelés origines de réplication ou origines. Le processus de copie se poursuit par la formation de fourches de réplication dans une ou deux directions jusqu'à ce que l'ADN soit complètement dupliqué. Dans les molécules d'ADN circulaires fermées, les brins nouvellement synthétisés sont liés de manière covalente aux points de rencontre des fourches de réplication croissantes ou au point où une seule fourche retourne à l'origine de la réplication. En règle générale, les molécules filles divergent avant le début d'un nouveau cycle de réplication.

Des génomes de taille aussi variée que le génome du virus SV40 (5,2 ko), bactériophage ? (48,5 kb) et E. coli (4-10,3 kb) sont reproduits à la suite d'un événement initiateur survenant à un moment donné.

Riz. 2. Mouvement possible du fork de réplication.

Chez les pro- et les eucaryotes, vous pouvez trouver diverses variations sur ce thème. Ainsi, chacune des chaînes de l'hélice mère de l'ADN mitochondrial animal (15 kb) possède sa propre origine de réplication. La synthèse de la chaîne complémentaire de certains petits génomes de phages simple brin commence à proximité d'une séquence spécifique, et la réplication du duplex résultant peut être initiée à un point complètement différent. La réplication de l'ADN double brin linéaire est également initiée sur des sites spécifiques. Par exemple, l'ADN du bactériophage T7 (40 kb) se réplique dans deux directions opposées vers des extrémités différentes de la molécule, en commençant à partir d'un point, et chacun des deux brins d'ADN de l'adénovirus humain (30 à 38 kb) se réplique séquentiellement toujours à partir de l'extrémité 3'. .

Les génomes des cellules eucaryotes sont caractérisés par la présence de multiples origines de réplication dispersées le long du chromosome à une distance d'environ 20 kb. Après le lancement, la réplication se poursuit dans deux directions à partir de chaque point jusqu'à ce que les branches de réplication de deux points de départ de réplication adjacents fusionnent. L'ADN complet de chaque chromosome fille est obtenu en joignant des brins nouvellement synthétisés plus courts et initiés indépendamment.

2.1. Le concept de réplicon et l'origine de la réplication

Le segment d'ADN sur lequel un seul fragment du brin principal est synthétisé est appelé le réplicon. Chez de nombreux procaryotes, leur génome ne contient qu’une seule origine de réplication, c’est-à-dire qu’ils n’ont qu’un seul réplicon dans leur ADN. Les génomes eucaryotes sont polyréplicons.

L'endroit où démarre le réplicon, où la réplication est initiée, est appelé l'origine de la réplication. C'est l'origine qui est reconnue par des complexes protéiques spéciaux et la formation d'une fourche de réplication commence dessus.

Dans certains cas, l'origine de la réplication a une séquence nucléotidique telle que le duplex prend une configuration inhabituelle reconnue par les protéines impliquées dans l'initiation. La nature de l'interaction entre l'origine de la réplication et les protéines et le mécanisme d'initiation dans son ensemble n'ont pas été suffisamment étudiés, cependant, on peut dire qu'ils sont apparemment différents selon les cas.

2.2. Origine de réplication d'E.coIi oriC

Les origines d’E. coli et de Bacillus subtilis ont été étudiées de manière très détaillée. L'origine de la réplication des chromosomes, oriC (origine du chromosome), comprend des régions avec des séquences spécifiques, appelées boîtes d'ADN, et de courtes séquences situées entre elles. Des boîtes d'ADN avec un « motif » spécifique de nucléotides, majoritairement de 9 pb, sont entrecoupées de fragments de 12-13 pb avec une teneur élevée en AT. Les séquences à neuf membres elles-mêmes peuvent être situées à la fois en position directe et inversée les unes par rapport aux autres. Par exemple, B. subtilis possède un fragment TTATCACA et deux autres boîtes à neuf chaînons orientées dans la direction opposée, l'une des paires de bases étant modifiée. Au total, B. subtilis possède 15 boîtes d'ADN sur oriC. La région oriC est très conservée : des boîtes d'ADN de composition similaire se retrouvent à l'endroit correspondant du chromosome chez d'autres bactéries (uniquement chez Mycoplasma genitalium, malgré la présence d'enzymes de réplication communes à toutes les bactéries, aucune boîte d'ADN n'a été trouvée). Les boîtes d’ADN elles-mêmes ne codent pas pour les protéines ou l’ARN, bien que des gènes individuels se trouvent entre elles. Les produits de ces gènes sont également largement impliqués dans le « maintien » du processus de réplication de l’ADN.

L'ordre de disposition des boîtes d'ADN, des régions intermédiaires et leur nombre suggèrent que la divergence évolutive d'oriC était principalement due à des duplications et des tripplications. Le schéma de "l'origine minimale" abstraite des procaryotes est présenté sur la fig. 3.

Riz. 3. Organisation de l'origine minimale des procaryotes

Schéma de l'origine minimale des procaryotes.

2.3. Origines d'autres organismes

La partie centrale de l'origine de la réplication dans le virus SV40 consiste en un élément de reconnaissance de l'origine (ORE), qui est nécessaire pour lier une protéine spécifique de l'antigène T (T-ag), un élément pour lier une protéine de déroulement de l'ADN (DUE) , et un élément enrichi en nucléotides AT. Le point auquel la branche de réplication commence à se déplacer dans des directions opposées est appelé origine de la réplication bidirectionnelle (OBR).

Les éléments auxiliaires (Aux) se lient aux dimères de l'antigène T (Aux-1) et du facteur de transcription Sp1 (Aux-2). La distance entre ces éléments et leur orientation jouent un rôle important dans le processus d'initiation de la réplication. Le schéma de l'origine du virus SV40 est présenté sur la fig. 4.

Chez les eucaryotes, les homologues d'origines de réplication sont des séquences à réplication autonome, ou ARS (autonomously réplication séquences), découvertes en 1980 par R. Davis et J. Carbon.

Riz. 4. Schéma de l'origine du virus SV40.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, des séquences spécifiques capables d'assurer la réplication de fragments d'ADN dans la cellule de levure ont été isolées plus tôt que chez les autres eucaryotes. Plus tard, de telles séquences ont été découvertes dans de nombreux autres organismes. Chez S. cerevisiae, l'ARS prend 100 à 200 pb et contient une séquence consensus spécifique (ACS - séquence consensus ARS), d'une taille de 11 pb, nécessaire à la liaison à la protéine initiatrice, ainsi que des éléments supplémentaires (éléments B) qui améliorent la fonction de l'origine. Par exemple, ARS1, la première origine caractérisée en détail, contient trois de ces éléments : B1, B2, B3. Les séquences ACS et B1 occupent environ 50 pb et représentent la plus petite région fonctionnelle de toute origine requise pour la liaison à une protéine initiatrice.

L'élément B2 contient généralement une région DUE génétiquement caractérisée. L'élément auxiliaire de l'OT se lie au facteur de transcription Abf-1. La longueur totale de l'élément ARS est de 100 à 200 pb. La structure de l'origine de S. cerevisiae est représentée sur la fig. 5.

Riz. 5. Schéma de l'origine de Saccharomyces cereiseae

Chez une autre espèce de levure, Shizosaccharomyces pombe, les origines consistent en au moins un ARS, qui est nettement plus long que celui de S. cerevisiae. Dans certains cas, plusieurs éléments ARS forment une zone d'initiation de réplication. (Fig.6.)

Riz. 6. Schéma de l'origine de Shizosaccharomyces pombe

Chez les mammifères, les origines n'ont pas été caractérisées en détail ; certaines d'entre elles sont situées dans des espaces intergéniques, possèdent des sites de liaison pour les facteurs de transcription et ne contiennent souvent que des régions d'initiation de la réplication bidirectionnelle (OBR).

2.4. Vitesse de réplication

Le taux de réplication du génome est principalement régulé par la fréquence des événements initiateurs. Par exemple, chez E. coli, le taux de copie dans chaque fourche de réplication est constant et égal à environ 1 500 pb par seconde : ainsi, un génome complet de 4 × 10 6 pb de longueur est répliqué en environ 40 min. Si le chromosome se réplique plus rapidement, cela signifie que la fréquence des événements d'initiation à la même origine de réplication augmente à la même vitesse de copie. Les cellules d'E. coli se divisent toutes les 20 minutes ; cela signifie que la réplication de l'ADN est initiée dans les chromosomes qui n'ont pas encore terminé le cycle de réplication précédent. La vitesse de déplacement de la fourche de réplication dans les cellules eucaryotes est bien moindre (10 à 100 pb par seconde), mais l'achèvement de la réplication chromosomique dans un délai raisonnable est assuré par une initiation simultanée en plusieurs points. Ainsi, le taux de réplication des chromosomes est contrôlé par le nombre et l’emplacement des origines de réplication. Par exemple, chez les premiers embryons de drosophile, la réplication d'un seul chromosome se produit toutes les 3 minutes en raison du déclenchement presque simultané d'événements en des points espacés de 7 000 à 8 000 pb. Dans le même temps, on sait que chez la drosophile, au début du développement embryonnaire, tant le taux de réplication que la taille et le nombre de réplicons sont spécifiques au tissu. Dans la culture de cellules somatiques de la même drosophile, le taux de duplication des chromosomes est beaucoup plus lent, puisque la réplication commence en un nombre beaucoup plus petit de points situés à une distance de 40 000 pb les uns des autres, tandis que la durée de la phase S est 600 minutes. Par conséquent, à un taux fixe de synthèse de l’ADN, l’initiation multiple augmente le taux du processus global de réplication et réduit ainsi le temps nécessaire pour dupliquer l’ensemble des chromosomes. Les données sur le nombre de réplicons et le taux de réplication sont présentées dans le tableau 1.

Des différences dans la durée de la phase S ont également été constatées chez d’autres organismes. Par exemple, chez le triton, la phase S dure 1 h dans les noyaux de la blastula et 200 h dans la phase S préméiotique des spermatocytes. La durée de la phase S n’est probablement pas déterminée par le taux de synthèse de l’ADN, mais par le nombre d’origines de réplication impliquées. Dans l'ADN des cellules de neurula du triton, elles sont situées à une distance d'environ 40 µm les unes des autres, et dans les cellules somatiques, à environ 100 µm.

Tableau 1

Nombre et longueur des réplicons dans différents organismes.

Conformément aux concepts modernes, les réplicons chez les eucaryotes ne sont pas répartis de manière aléatoire dans le génome, ils sont disposés en groupes (foyers de réplicons). Dans ces groupes, ou foyers, des enzymes de réplication sont assemblées qui allongent simultanément les fourches de réplication de 10 à 100 réplicons voisins, chacun mesurant environ 100 kb de long. La réplication y est terminée en 45 à 60 minutes. De plus, il existe des réplicons très longs (plus de 1000 Ko), si grands que la réplication y dure plusieurs heures.

L'activation des origines de réplication se produit tout au long de la phase S. Par exemple, S. cerevisiae ARS1 est activé au début de la phase S, tandis que ARS501 est activé à la fin de la phase S. La plupart des origines sont activées au milieu de la phase S. Il est intéressant de noter que les segments des chromosomes de S. cerevisiae qui se répliquent au début ou à la fin de la phase S sont disposés selon un motif en mosaïque, c'est-à-dire qu'ils sont mélangés. Chez S. cerevisiae, il a été constaté que la région centrale du chromosome IV se réplique au début de la phase S, tandis que les télomères se répliquent à la fin de la phase S. Un fragment d'ADN de 67 kb adjacent au télomère à l'extrémité droite du chromosome V et contenant ARS501 se réplique à la fin de la phase S. Apparemment, la réplication tardive de cette région du chromosome est une conséquence de sa proximité avec le télomère. De plus, on sait que des gènes « silencieux » sont répliqués à la fin de la phase S, par exemple les loci HML et HMR qui ne sont pas exprimés dans certains types cellulaires et sont localisés dans des régions subtélomériques. Les gènes activement exprimés, comme le locus MAT, se répliquent au contraire dans la première moitié de la phase S.

Chapitre 3 Lancement de la réplication

Les origines de réplication sont l'endroit à partir duquel la fourchette de réplication commence son mouvement. Mais les ADN polymérases ne peuvent pas démarrer le processus de réplication sans l’aide d’autres protéines. Des protéines impliquées dans la reconnaissance de l'origine et contribuant à attirer vers elle la primase - l'ARN polymérase qui synthétise l'amorce, la « graine » de la synthèse de l'ADN - et l'ADN polymérase forment le complexe d'initiation de la réplication.

3.1 Initiation de la réplication dans E. coli

L'initiation de la réplication dans oriC dans le système in vitro commence par la formation d'un complexe qui comprend six protéines : DnaA, DnaB, DnaC, HU, Girase et SSB. Tout d’abord, le monomère DnaA se lie à la séquence à neuf chaînons, puis 20 à 40 monomères de cette protéine forment un grand agrégat. L'ADN d'origine l'entoure et les brins d'ADN sont séparés au niveau de trois séquences de treize chaînons. A l'étape suivante, le dimère DnaB/DpaC rejoint le complexe oriC/DnaA, formant un agrégat d'environ 480 kDa, correspondant à une sphère de rayon 6 nm. En conséquence, un fork de réplication est formé.

3.2. Initiation à la réplication chez les eucaryotes

L'initiation de la réplication de l'ADN eucaryote commence par la formation d'un complexe de l'origine de la réplication et de la protéine initiatrice de la réplication. Ce complexe est appelé postréplicatif (post.-RC). Il sert de plate-forme pour l’assemblage de structures d’ordre supérieur qui placent la chromatine dans un état compétent pour la réplication. Les étapes successives de formation des complexes d'initiation de réplication sont représentées sur les Figs. 7.

L'initiateur de la réplication de l'ADN dans les cellules eucaryotes est l'ORC (complexe de reconnaissance d'origine), décrit pour la première fois chez S. cerevisiae. Par la suite, des protéines de type ORC ont été découvertes et étudiées chez d'autres représentants des eucaryotes, ainsi que chez les mammifères et les humains. Chez tous les eucaryotes, l'ORC est formé de six sous-unités, Orc1-Orc6 (120-50 kDa). Les six sous-unités du complexe sont essentielles à l'activité vitale de S. cerevisiae. Deux groupes différents de sous-unités ORC sont impliqués dans la reconnaissance des séquences de l'origine lorsqu'elle se lie à l'origine de réplication. Ogc1, Ogc2 et Ogc4 interagissent avec ACS, les trois sous-unités restantes reconnaissent les éléments de type B1. Il est possible que seul Orc5 se lie aux séquences nucléotidiques B1. ORC se lie spécifiquement à l'ADN uniquement en présence d'ATP et possède une activité ATPase, qui est régulée par l'interaction coordonnée de la protéine avec les éléments ATP et ARS. L'ATP se lie à la sous-unité Orc1 et joue le rôle de cofacteur nécessaire à l'attachement de l'ORC à l'origine. La séquence d'origine spécifique liée à ORC inhibe l'activité ATPase d'Orc1, tandis que les régions d'ADN simple brin apparaissant en phase S la réactivent. Dans le même temps, la conformation ORC passe d'étendue (étendue) à courbée (courbée). Il est possible que la liaison et l'hydrolyse de l'ATP par la sous-unité Orc1 soient impliquées dans le contrôle des fonctions ORC dans le cycle cellulaire.

Chez la levure à fission S. mombe, la protéine Orc4 contient ce que l'on appelle des « crochets AT » dans le domaine N-terminal, par lesquels ORC se lie à plusieurs régions d'ARS1 riches en séquences AT. Chez S. cerevisiae, l'ORS s'attache à l'origine à la fin de la mitose, formant un complexe post-réplication (post-RC), et y reste associé dans les cycles cellulaires ultérieurs. Dans le même temps, le post-RC existe dans les phases S, G2 et M, et dans la phase G1, il fait partie du complexe pré-réplicatif (pré-RC).

Le complexe préréplicatif est formé sur la base du post-RC ; ce processus commence dans toutes les origines simultanément à la limite des phases M et G1 et se termine à la fin de G1 dans les origines qui sont activées en premier lors du passage à la phase S. . Dans les origines qui sont activées plus tard dans la phase S, la formation des pro-RC s'achève dans la période de phase S correspondant à chacune d'elles. Dans la phase G1 lors de l'assemblage du pro-RC, ORC est capable d'interagir avec les kinases cyclines-dépendantes (Cdks, cyclin-dependent kinases). Cette interaction est l'un des mécanismes qui permettent à la cellule de former du pro-RC après la mitose. La protéine Cdc6 (protéine du cycle de division cellulaire) et la famille de six protéines Mst 2 à 7 (protéines de maintenance des minichromosomes) sont les premières à rejoindre post-RC à la limite de phase M/G1. Les protéines Mst 2 à 7 sont les plus connues de la famille des protéines de « maintenance des mini-chromosomes » identifiées pour la première fois dans S. cerevisiae dans l'étude de mutants incapables de maintenir la stabilité des mini-chromosomes.

Riz. 7. Schéma d'initiation de la réplication chez les eucaryotes

Les protéines Cdc6 et Mst 2–7 ont été décrites chez de nombreux représentants des eucaryotes, y compris les mammifères. Il a été récemment démontré que les cellules S.rotbe et chez les eucaryotes supérieurs, une autre protéine, Cdt1 (terminaison de la division cellulaire), est impliquée dans le stade précoce de la formation du pro-RC. Les protéines Mst 2 à 7 forment le complexe hexamérique MSM, composant clé du pro-RC. Le MSM génère un signal de contrôle sur la chromatine non répliquée pour inhiber la mitose prématurée dans la phase G1. Il est également nécessaire de déplacer la cellule tout au long du cycle jusqu'à la phase S. L'attachement du MSM à l'origine de la réplication est régulé par la phosphorylation-déphosphorylation des sous-unités individuelles de ce complexe. Par exemple, la déphosphorylation partielle de la sous-unité Mst4 hyperphosphorylée en phase M favorise la formation de pro-RC, tandis que la déphosphorylation complète de la sous-unité Mst3 inactive le complexe et empêche sa liaison à la chromatine. Dans le même temps, l’attachement du MSM à l’origine dépend des protéines Cdc6 et Cdt1, qui « implantent » conjointement le MSM sur la chromatine. En l'absence de cellules CD6 S. cerevisiae perdent la capacité d'initier la réplication de l'ADN et subissent une mitose « tronquée » et les chromosomes non répliqués se séparent de manière aléatoire vers les pôles du fuseau.

La capacité de Cdc6 à empêcher la mitose « tronquée » jusqu'à la fin de la réplication de l'ADN est assurée par son interaction avec Cdks. L'activité de Cdc6 dans la phase G1 est également régulée par son interaction avec l'ATP, puisque des mutations dans les séquences conservées du motif Cdc6 se liant à l'ATP ont conduit à la perte de la capacité de la chromatine à attacher le MCM dans les cellules. S. cerevisiae et à la suppression de la réplication de l'ADN dans les cellules humaines. À S. cerevisiae une autre protéine, Mcm10, associée à la chromatine et interagissant avec les composants de Mst2-7, est impliquée dans la fixation de MCM au pro-RC. Un contrôle aussi complexe de la liaison du MSM à l'origine indique que la cellule possède un système à plusieurs étapes de mécanismes de régulation nécessaires pour empêcher des mitoses répétées en présence de chromatine non répliquée. La liaison du MSM aux origines de réplication est nécessaire pour assurer la stabilité du génome ; c’est cette liaison qui met la chromatine dans un état appelé licence de réplication. Pour keyenopus, la liaison MCM nécessite un facteur supplémentaire du même nom, RLF-B (facteur de licence d'herlication B). Les protéines MCM présentent une affinité pour les histones plutôt que pour l'ADN, ce qui entraîne à la fin de la phase G1, l'ensemble du complexe de préréplication est fermement attaché à la chromatine directement à l'origine de la réplication ou à proximité.

Dans la phase G1, la kinase Cdc7 avec sa sous-unité régulatrice Dbf4 (facteur de liaison à l'ADN 4) rejoint le pro-RC partiellement formé, et à la fin de la phase G1 ou à la limite de la phase G1/S, la protéine Cdc45 et l'ADN simple brin -la protéine réplicative A de liaison (RPA, protéine de réplication A). L'interaction entre Cdc45 et Dbf4/Cdc7 à la fin de la phase G1 est nécessaire pour la « mise en marche » ultérieure de la réplication dans les origines après l'assemblage pro-RC.

La kinase Dbf4/Cdc7 se lie à ori quelque temps avant de commencer à remplir ses fonctions. Ayant rejoint pro-RC, la kinase Dbf4/Cdc7 « attend » l’activation de Cdk, et seulement après cela, elle phosphoryle ses substrats. Le rôle de la liaison « précoce » de cette kinase à ori reste flou.

La liaison de Cdc45 à la chromatine dépend des protéines Cdc6 et Mst2 et de l'activité de la kinase Dbf4/Cdc7 et des kinases de phase S dépendantes de la cycline (phase Cdk-S - Cdc28/Ckb5.6 chez la levure et Cdk2/Cuclins A ,E chez les eucaryotes supérieurs). La protéine Cdc45 peut être phosphorylée par la kinase Dbf4/Cdc7, mais cela ne se produit qu'après activation de la phase Cdk-S. L'activité Cdk-S, à son tour, est régulée par l'inhibiteur Sic1, qui subit une protéolyse dépendante de l'ubiquitine à la fin de la phase G1. L'attachement de la protéine Cdc45 au pro-RC se produit à la fin de la phase G1 du cycle cellulaire uniquement sur les origines des réplicons qui démarrent en premier la synthèse de l'ADN lors de la transition vers la phase S. La liaison dépendante de Cdk-S et Dbf4/Cdc7 de Cdc45 à d'autres origines est réalisée à un moment précis pour chacune d'elles tout au long de la phase S. Le mécanisme probable d'attachement de Cdc45 au pro-RC est le suivant : Dbf4/Cdc7, lié à toutes les origines de réplication de la phase G1, après exposition à Cdk-S, phosphoryle Mst2 dans chaque origine pendant cette période de la phase S, qui est déterminé individuellement pour chaque origine. À la suite de la phosphorylation de Mst2, la conformation du complexe MCM change de telle manière qu'il acquiert la capacité de se lier à Cdc45. Dans le même temps, la protéine RPA s’attache au pro-RC. Comme Cdc45, RPA se lie à l'origine Cdk-S de manière dépendante avec la participation de Mst2. L'attachement des protéines Cdc45 et RPA complète l'assemblage pro-RC. Immédiatement après l'achèvement de l'assemblage du pro-RC, sa dissociation partielle se produit, accompagnée du début de la formation du RC (complexe de réplication). La protéine Cdc6 est la première à se dissocier du pro-RC lors du passage de la phase G1 à S ou même plus tôt, subissant une phosphorylation sous l'action de Cdks, suivie d'une ubiquitination et d'une dégradation. Cette voie d'inactivation de Cdc6 a été démontrée à la fois pour les eucaryotes inférieurs et pour certains représentants d'eucaryotes supérieurs. Dans les cellules humaines, le niveau de Cdc6 reste constant tout au long du cycle cellulaire. Mais lors du passage à la phase S, Cdc6 est transporté du noyau vers le cytoplasme. Apparemment, ce processus est également réglementé par Cdks. L'élimination de Cdc6p du noyau (par hydrolyse ou transport vers le cytoplasme) est l'un des mécanismes empêchant de multiples événements de réplication au cours d'un cycle cellulaire.

La protéine Cdt1 est également inactivée une fois la formation de pro-RC terminée. Parallèlement, dans les cellules des eucaryotes inférieurs, Cdt1. il s'exprime périodiquement, s'accumulant dans les noyaux en phase G1, et en phase G2 son niveau diminue. Chez les eucaryotes supérieurs, l'activité de Cdt1 est contrôlée par la protéine inhibitrice géminine, qui est absente dans les cellules en phase G1, s'accumule pendant les phases S et G2, et partiellement pendant la phase M, et disparaît dans la phase M à la métaphase-anaphase. frontière.

Contrairement à Cdc6 et Cdt1, les protéines Mst2-7, RPA et Cdc45, dissociées du pro-RC, restent associées à la chromatine en phase S lors de la synthèse de l'ADN. La libération rapide de MCM à partir de pte-RC dans les cellules de levure est médiée par l'interaction entre Mcm10 et Mst7. La séparation du MSM et du Mst10 est facilitée par la protéine Cdc45.

Les sous-unités Mst4,6,7 du complexe MSM ont une activité hélicase, qui se manifeste uniquement lors d'une stimulation sous l'action de la kinase Cdk-S et Dbf4/Cdc7. Les protéines Mst2-7 sont essentielles non seulement à l'initiation, mais également à la phase d'élongation de la réplication, à la progression des fourches de réplication. MSM fait partie de RC et est impliqué dans le déroulement de l'ADN double brin dans les fourches de réplication. Dans les cellules humaines, la liaison du MCM à l'origine lors de la formation du RC s'effectue avec la participation de la protéine Mcm10, qui s'accumule et forme un complexe avec la chromatine en phase S, contrairement à Mcm10. S. seguevisiae. Lors de la transition des cellules de la phase G2 à M, Mcm10 hyperphosphoryle et se dissocie de la chromatine, et à la limite de phase M/G1, elle subit une protéolyse par le mécanisme du protéasome. Ainsi, la phosphorylation et la protéolyse de Mcm10 dans les cellules humaines régulent négativement l’activité du MSM une fois la réplication de l’ADN terminée. De plus, une régulation négative de l’activité du MSM peut résulter de la phosphorylation directe de composants individuels de ce complexe lui-même. Par exemple, la phosphorylation des sites Mcm4 spécifiques de Cdk dans la phase M entraîne une perte de l'activité hélicase de Mst4,6,7 et une concentration élevée du complexe Cdk-cycline E dans les noyaux des embryons. Hépore empêche la liaison de Mst3 à l'ADN et empêche ainsi la réassociation du MSM avec la chromatine une fois la réplication terminée. Le complexe MCM est impliqué non seulement dans les premières étapes de l'initiation de la réplication lors de la transition des cellules vers la phase G1, mais également dans l'achèvement de ce processus dans la phase S. Les composants de la formation de RC. Par conséquent, les multiples mécanismes de régulation de l’activité des HSH sont tout à fait compréhensibles. Si dans la phase G1, ces mécanismes visent à promouvoir les cellules vers la phase S sans mitoses répétées, alors dans les phases S et G2, ils empêchent la réplication de la chromatine déjà répliquée.

La RPA est une protéine qui lie l'ADN simple brin, et sa présence dans RC au début de la réplication est nécessaire pour stabiliser la région d'ADN non torsadée. La RPA est formée de trois sous-unités ayant des poids moléculaires de 70, 34 et 11 kDa, la sous-unité de 70 kDa ayant une activité de liaison à l'ADN simple brin, tandis que la sous-unité de 34 kDa est régulatrice. Cette dernière est phosphorylée par Cdk, ce qui semble nécessaire à l'activation de la réplication de l'ADN. Une description détaillée de ce complexe sera donnée ci-dessous.

La protéine Cdc45 est également impliquée dans la formation du RC. Est-il nécessaire que l’ADN polymérase se fixe ? aux origines de la réplication. Il a été démontré que la protéine humaine Cdc45 se lie à la protéine humaine Mst7 et à la sous-unité p70 de l'ADN polymérase ? in vitro. Cdc45 attache l'ADN polymérase ? à RC via la liaison à Mst7. Dans les cellules de levure S. cerevisiae Cdc45 attache l'ADN polymérase ? à la chromatine avec la participation de Mst2.

L’ADN polymérase est l’un des composants du complexe qui déclenche la réplication de l’ADN. Parmi toutes les nombreuses ADN polymérases eucaryotes, c'est elle qui contient l'activité primase, capable de synthétiser une courte « graine » d'ARN - une amorce à partir de ribonucléosides triphosphates. L'amorce ARN génère un signal qui est l'un des déclencheurs de la réplication. ADN polymérase ? trouvé chez tous les eucaryotes étudiés et bien étudiés. Une description détaillée de cette enzyme sera donnée dans la section suivante. Il a été démontré que l'un des moyens de réguler l'initiation de la réplication est associé à la phosphorylation de deux grandes sous-unités de l'ADN polymérase ? sous l'influence de CDK. Dans le même temps, la cycline E et Cdk stimulent l'initiation de la réplication lors du passage de la cellule vers la phase S, tandis que la cycline A et Cdk l'inhibent en phase G2.

Evidemment, l'activation des origines « actives précoces et tardives » mentionnées ci-dessus S. cerevisiae dépend de la kinase Dbf4/Cdc7p. Il est probable que chaque origine soit régulée localement par des protéines kinases supplémentaires, telles que Rad53. Kinase Rad53 bloque le lancement d'origines « tardives » au début de la phase S. Lorsque ce blocage est levé, la kinase Dbf4/Cdc7p active le MSM, ce qui entraîne plusieurs conséquences à la fois : stimulation de l'activité hélicase du MSM et liaison de la protéine RPA et de l'ADN polymérase ? avec des origines de réplication. Attachement de l'ADN polymérase ? au RC, le déroulement de l'ADN à l'origine et la synthèse des amorces d'ARN complètent l'initiation de la réplication de l'ADN eucaryote. Il convient de noter que le rôle de l’ADN polymérase ? limité au début de la réplication de l’ADN. Cette ADN polymérase n'est pas capable de synthèse d'ADN processive, c'est-à-dire étendue, et n'a pas d'activité corrective. Par conséquent, plus tard dans le processus de réplication, il ajoute environ 20 nucléotides à l’amorce ARN et est remplacé par des ADN polymérases ? ou?.

Le post-RC, avec la formation duquel commence toute la chaîne d'événements du processus d'initiation de la réplication de l'ADN, subit des changements dans la phase S du cycle cellulaire. Ces changements concernent l'affinité de l'ORC pour l'ADN. Par exemple, la protéine Orc1 Khéporis forme un complexe fort avec la chromatine au début de l'interphase jusqu'à ce que l'assemblage du pro-RC soit terminé. Puis, en phase S, l’affinité d’Orc1 pour l’ADN diminue. Chez les mammifères, Orc1 se dissocie de la chromatine en phase S, se transforme en une forme mono- ou di-ubiquitinée, puis se désubiquitine et se lie à nouveau à l'ADN lors de la transition de la phase M à la phase G-1. La protéine O2, quant à elle,

reste associé à la chromatine tout au long du cycle cellulaire et n'est pas un substrat pour l'ubiquitination. Dans les cellules humaines en phase S, un complexe de protéines contenant Orc1 et Orc2 se dissocie de la chromatine, qui se réassocie à la fin de la mitose. Dans les cellules de levure S.rotbe ORC subit des changements post-traductionnels dans le cycle cellulaire : en phase S, commence la phosphorylation d'une de ses sous-unités, Orc2, qui atteint un maximum dans les phases G2 et M. Ainsi, dans les cellules eucaryotes, l'un des mécanismes empêchant la la réplication de la chromatine déjà répliquée est associée à -RC soit par dissociation d'Orc1 (chez les eucaryotes supérieurs), soit par phosphorylation d'Orc2 (chez les eucaryotes inférieurs).

Tableau 2

Complexes d'initiation de la transcription chez les eucaryotes

Pour faciliter la compréhension de la séquence de liaison de diverses protéines à l'origine de la réplication, voir le tableau 2.

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes de régulation de presque toutes les étapes de l'initiation de la réplication. Ils sont réalisés au niveau du fonctionnement de tous les composants qui forment des complexes post-, pré- et réplicatifs. Ces composantes sont affectées non pas par un mais par plusieurs facteurs différents. Un exemple en est la régulation du complexe MSM, dont l’activité dépend directement des protéines Cdc6, Mst10, Cdt1, des kinases cyclines dépendantes, de la kinase Dbf4/Cdc7 et des phosphatases. Les régularités du processus d'initiation de la réplication de l'ADN au cours de l'embryogenèse et les facteurs qui influencent ces processus sont encore mal compris.

Chapitre 4

4.1. Synthèse d'amorce pour la réaction de polymérase

Les ADN polymérases ne peuvent pas démarrer la synthèse de l'ADN directement sur la matrice, mais peuvent uniquement ajouter de nouvelles unités désoxyribonucléotidiques à l'extrémité 3" d'une chaîne polynucléotidique existante. Une telle chaîne préformée à laquelle des nucléotides sont ajoutés est appelée une amorce (ou amorce), elle se compose d'ARN L'amorce d'ARN court est synthétisée à partir de ribonucléosides triphosphates par une enzyme appelée ADN primase. L'activité de la primase peut appartenir soit à une seule enzyme, soit à l'une des sous-unités de l'ADN polymérase. La primase se lie à l'hélicase et à l'ADN, formant une structure appelée primosome, et synthétise une amorce d'ARN. Les amorces d'ARN sont allongées par l'action de l'ADN polymérase III chez les procaryotes et par l'ADN polymérase A chez les eucaryotes. Schématiquement, ce processus sur un brin en retard est représenté sur la figure 8. E. coli les amorces sont synthétisées par une enzyme distincte spéciale - la primase.

Riz. 8. Amorces d’ARN sur le brin en retard

4.2. Le concept de duplex ARN-ADN

L'ADN est généralement présent dans une cellule sous la forme B. De plus, deux autres formes possibles de l'état de l'ADN, A et Z, sont décrites. Ces formes sont représentées sur la figure. 9. L'interaction des bases dans la forme B est illustrée à la fig. dix.

Dans la forme A, les plans de base font un angle de 20 degrés avec la perpendiculaire à l'axe de l'hélice (dans la forme B - 0), la distance entre les paires de bases diminue à 0,29 nm (dans la forme B - 0,34 nm), le nombre de paires par tour passe à 11 -12 (sous forme B - 10).

Les paires de bases de forme A sont très fortement éloignées de l'axe de l'hélice vers la périphérie de la molécule - près de la moitié du rayon ; le décalage atteint 4 à 5 Å et, dans la forme B de l'ADN, il est proche de zéro.

Riz. 9. Formes possibles d'ADN

Lors de la formation d'une amorce (le processus de sa synthèse sera présenté plus en détail lors de la description de l'ADN polymérase eucaryote), un duplex ADN-ARN se forme, qui existe sous la forme A. Donc

Ainsi, dans la forme A du duplex, un équilibre optimal est assuré entre les interactions hydrophobes et complémentaires des bases de la matrice et de l'amorce.

Riz. 10. Disposition mutuelle des nucléotides dans l'ADN sous la forme B

4.3. Enzymes clés impliquées dans la synthèse de l'ADN

De nombreux détails désormais connus du processus de réplication de l'ADN ont été établis grâce à l'étude du comportement et de l'activité des enzymes qui assurent le fonctionnement de l'appareil de réplication. Le mécanisme de réplication de l'ADN bactérien, en particulier l'ADN E. coli et les bactériophages qui s'y multiplient. Les enzymes de réplication de la levure sont bien connues, la drosophile, les mammifères.

4.3.1. ADN polymérase

Les subimsrazases d'ADN sont présentes dans toutes les cellules procaryotes et eucaryotes. De plus, de nombreux virus bactériens et animaux induisent la formation d’ADN polymérases ou de protéines spécifiques du virus qui facilitent la participation efficace des ADN polymérases des cellules hôtes à la réplication de l’ADN viral.

De nombreuses ADN polymérases procaryotes et eucaryotes ont été isolées sous forme pure et leurs propriétés physiques et enzymatiques ont été caractérisées en détail. Et bien que ces propriétés ne soient pas totalement identiques, le mécanisme de catalyse pour toutes ces enzymes est en général le même.

Riz. 11. Le principe général de la structure des ADN polymérases.

La structure primaire des ADN polymérases eucaryotes contient des motifs conservés homologues aux motifs correspondants des enzymes procaryotes. Cela confirme que toutes les enzymes synthétisant l’ADN partagent un plan structurel commun. Le principe général de la structure des ADN polymérases est présenté sur la fig. 11. La forme de l'ADN polysrase peut être comparée à une main droite entrouverte, dans laquelle la paume, le pouce et les autres doigts représentent les trois domaines spatiaux principaux et forment une cavité qui contient la matrice d'ADN et l'amorce pendant la synthèse. Les motifs conservateurs A, B et C forment un centre actif dans le domaine de la « paume », les « doigts » tiennent le modèle simple brin et le « pouce » appuie sur l'amorce, la région du modèle double brin.

Appliqué à différents types d’ADN polymérases eucaryotes, ce modèle peut être modifié. Les ADN polymérases fonctionnent en conjonction avec divers complexes protéiques qui les maintiennent sur la fourche de réplication. Le plus souvent, ils sont appelés « pince » et « chargeur à pince » (« pince coulissante », « chargeur à pince »).

Après avoir combiné l'ADN polymérase avec la pince, le « chargeur de pince » s'éloigne du site de réaction mais reste proche du brin en retard pour se charger sur le nouveau site de fusion amorce-modèle une fois que l'ADN polymérase s'est dissociée à la fin de la synthèse de le fragment précédent d'Okazaki. Ce processus est schématisé sur la Fig. 12. Ces complexes chez les eucaryotes et leur rôle dans la réplication seront discutés plus en détail ci-dessous.

4.3.1.1. ADN polymérases procaryotes

Les polymérases procaryotes sont désignées par des chiffres romains (contrairement aux polymérases eucaryotes, qui sont désignées par des lettres grecques). L'ADN polymérase I (Po11) a été la plus étudiée. E. coli. Il s'agit d'un polypeptide unique doté d'activités multifonctionnelles. En tant qu'ADN polymérase, Po11 catalyse le transfert des unités 5"-désoxynucléotidyle des désoxynucléoside-5"-triphosphates vers le groupe 3"-OH de la chaîne d'ADN ou d'ARN, après quoi la base transférée est appariée à la base correspondante du complémentaire. Chaîne d'ADN. Ainsi, pour la polymérisation, l'enzyme a besoin d'une amorce en tant qu'accepteur de désoxynucléotide et d'une matrice qui détermine la fixation du nucléotide souhaité. En plus de la polymérisation des nucléotides, Po11 catalyse deux autres réactions dont le rôle biologique est très important. .Dans l'un d'eux, hydrolyse des liaisons phosphodiester dans un brin d'ADN ou à l'extrémité non appariée de l'ADN duplex, de plus, un nucléotide est éliminé en un seul acte, à partir de l'extrémité 3" de la chaîne ( 3"-5"-exonucléase). La deuxième réaction consiste également en un clivage de nucléotides, mais l'hydrolyse commence de l'extrémité 5' de l'ADN double brin vers l'extrémité 3' (5'-3'-exonucléase). Ces différentes activités sont inhérentes à différents sites de la chaîne polypeptidique PolI. Si PolI est traité avec de la trypsine in vitro, la chaîne polypeptidique est divisée en grands et petits fragments. Le grand fragment C-terminal (« fragment de Klenow ») conserve les activités d'ADN polymérase et d'exonucléase 3"-5" ; le petit fragment N-terminal n'a qu'une activité 5'-3'-exonucléase.

Le rôle I et ses activités exonucléases inhérentes jouent un rôle très important dans la réplication et la réparation de l'ADN chromosomique. E. coli. L'activité 3'-5"-exonucléase permet de contrôler la fixation de chaque nucléotide et l'élimination des nucléotides erronés de la chaîne nouvellement synthétisée. Si cette activité est supprimée à la suite de certaines mutations dans le gène codant pour PolI, alors des mutations se produisent souvent pendant réplication du génome - substitutions de bases.

La capacité de l'ADN polymérase à étendre l'extrémité 3" du brin associé au brin matriciel lui permet de combler les espaces entre les segments du brin en retard. PolI étend les fragments d'Okazaki à partir des extrémités 3" et supprime les ribonucléotides amorces dont les extrémités 5" des fragments adjacents commencent, ce qui est une condition préalable nécessaire à la formation d'un brin retardateur continu. Parce que PolI est capable d'étendre l'extrémité 3" de l'un des brins à la rupture de l'ADN double brin et d'éliminer les nucléotides de la fin 5" du même break (un processus appelé traduction de pseudo ), cette enzyme joue un rôle clé dans la réparation de l'ADN endommagé. La traduction de Nick est largement utilisée in vitro pour la synthèse d'ADN radiomarqué.

À E. coli il existe deux autres ADN polymérases, mais elles sont présentes dans la cellule en plus petites quantités. PolII attache les nucléotides beaucoup moins efficacement que Po11 et n'a pas d'activité 5'-3'-exonucléase. Par conséquent, PolII peut combler les lacunes entre les fragments d'ADN associés au brin matrice, mais n'est pas capable de cliver les nucléotides d'ARN des fragments d'Okazaki ni d'effectuer une traduction de pseudo. Rôle du rôle II dans la réplication et le maintien de l'ADN chromosomique E. coli jusqu'à présent, ce n'est pas clair. Il peut probablement être impliqué dans la restauration de la synthèse de l'ADN après dommage et arrêt de la fourche de réplication. Ce processus est appelé resynthèse.

L'holoenzyme PolIII est l'enzyme clé responsable de la réplication de l'ADN chromosomique E. coli. Chaque cellule ne contient que 10 à 20 copies de PolIII, une holoenzyme, mais c'est elle qui est le composant principal du complexe multienzyme polymérase qui initie la formation de fourches de réplication aux origines de réplication, participe à l'élongation du brin principal dans le fourche et allonge les amorces d’ARN avec formation de fragments d’Okazaki. Puisque PolIII, une holoenzyme, n'a pas d'activité 5'-3'-exonucléase, la réplication du brin en retard nécessite la participation de PolI pour que le produit formé avec la participation de PolIII soit allongé et que les amorces d'ARN soient éliminées à l'extrémité 5' des fragments d'Okazaki.

L'analyse mutationnelle dirigée a révélé des changements dans la chaîne polypeptidique de l'enzyme principale (noyau) PolIII et a étudié les substitutions d'acides aminés qui permettent d'attribuer certains types d'activité enzymatique à des sous-unités spécifiques du complexe enzymatique. Ainsi, la sous-unité α a une activité polymérase, tandis que la sous-unité α a une activité 3'5'-exonucléase. Cependant, le complexe de sous-unités ß et ß a une activité polymérase et exonucléase significativement plus élevée que chacune des sous-unités correspondantes séparément. La fonction de la troisième sous-unité ? n'est pas encore claire.

En plus des sous-unités qui composent le noyau PolIII, l'holoenzyme PolIII contient sept autres sous-unités : ?, ?, ?, ?, ?', ? et ?. Les polypégides répertoriés existent également en de nombreux exemplaires, c'est pourquoi ils disent. la masse du complexe polymérase est d'environ 10 3 kDa. Le rôle de la sous-unité ? est de minimiser le risque que l'enzyme se sépare du modèle avant que le processus de copie ne soit terminé, c'est-à-dire qu'elle fonctionne comme une « pince ». Sous-unité ? est un facteur de dimérisation des holoenzymes réplicatives. La fonction exacte des autres sous-unités est inconnue. Il est fort possible que PolIII-holoenzyme existe sous deux formes, chacune contenant un certain ensemble de sous-unités auxiliaires qui confèrent certaines propriétés à l'enzyme. Sous une forme, l’enzyme catalyse la synthèse d’un brin leader continu et, sous l’autre, d’un brin retardé discontinu.

L'holoenzyme PolIII catalyse les mêmes réactions de synthèse que PolI, mais fonctionne environ 60 fois plus rapidement. De plus, l’holoenzyme PolIII a une affinité accrue pour la matrice et offre une efficacité de copie plus élevée. L'holoenzyme PolIII peut également se lier à d'autres protéines, augmentant ainsi l'efficacité du processus de copie en coordonnant certaines des étapes enzymatiques importantes de la réplication. A ce niveau d'organisation supérieur, les complexes peuvent inclure des protéines qui déroulent l'hélice d'ADN au niveau des origines et des fourches de réplication (hélicases), initient la formation d'ARN amorces (primases), assurent l'extension séquentielle des chaînes d'ADN, terminent le processus de réplication, et séparez les hélices d'ADN filles.

Les ADN polymérases synthétisées par d'autres bactéries et de nombreux bactériophages diffèrent par leur structure physique et leurs propriétés. Cependant, les réactions qu'ils catalysent sont presque identiques à celles étudiées dans E. coli. Toutes les ADN polymérases possèdent une 3'-5'-exonucléase corrective, mais la plupart des enzymes n'ont pas de 5'-3'-exonucléase. Par exemple, l'ADN polymérase du phage T4 peut effectuer la réaction 3'-5'-exonucléase et corriger les erreurs de réplication, mais n'est pas capable de catalyser la réaction 5'-3'-exonucléase et ne peut donc pas fournir de traduction de pseudo. Dans la réplication de l'ADN du phage T4, une autre protéine codée par le phage catalyse la réaction d'exonucléase 5'-3' pour éliminer les amorces d'ARN avant de combiner les fragments d'Okazaki. Dans le processus de synthèse intermittente des brins en retard et de réparation des dommages à l'ADN du phage T4, cette enzyme fonctionne de concert avec l'ADN polymérase du phage. Certains virus animaux (par exemple, l'herpèsvirus, le virus de la vaccine et le virus de l'hépatite) induisent la synthèse de polymérases spécifiques pour répliquer leur génome.

D'autres virus forment des protéines qui stimulent les systèmes de réplication de l'ADN cellulaire ou participent à la réplication de l'ADN viral. Par exemple, les papovavirus synthétisent les protéines nécessaires pour initier la réplication. Les adénovirus humains codent pour des protéines qui « déclenchent » l'initiation de la synthèse des deux brins d'ADN viral linéaire. Ils produisent également des protéines spéciales liant l’ADN qui facilitent la réplication.

4.3.1.2. ADN polymérases eucaryotes

De nombreuses ADN polymérases ont été identifiées dans les cellules eucaryotes, mais leurs propriétés physiques et fonctionnelles ont été étudiées de manière moins détaillée que celles des enzymes procaryotes correspondantes.

Tableau 3

ADN polymérases eucaryotes

La structure spatiale exacte déterminée par analyse par diffraction des rayons X n'est connue que pour une ADN polymérase eucaryote, la polymérase de type β, dont la structure diffère nettement de celle des autres ADN polymérases eucaryotes. Un résumé des principales polymérases eucaryotes est présenté dans le tableau 3.

4.3.1.3. ADN polymérase ? – prime

Dans les cellules eucaryotes, la synthèse de l'ADN se produit principalement dans des structures denses spécifiques (« usines de réplication ») attachées à une matrice nucléaire diffuse. On suppose que les phospholipides jouent un certain rôle dans l'organisation moléculaire de la matrice nucléaire et que l'ADN est associé au squelette nucléaire par des interactions hydrophobes. Les « usines de réplication » ou complexes de réplication 21S regroupent un groupe d'enzymes constitué d'au moins 30 protéines d'un poids moléculaire de 15 à 300 kDa, et contiennent, outre l'ADN polymérase ? - les primases également la 3 "-5"-exonucléase, l'ADN ligase I, la RNase H, l'ADN topoisomérase I, l'ADN hélicase, la PCNA et un certain nombre d'autres facteurs. Ce complexe contient également du RPA, qui interagit spécifiquement avec la sous-unité p48 du complexe polymérase-primase. Un apport important en ADN polymérase ? s'accumule dans les œufs des échinodermes, des amphibiens, des poissons osseux et de la drosophile pour assurer une réplication intensive de l'ADN nucléaire au début du développement.

Généralement de l'ADN polymérase ? ne possèdent pas d'activité correctrice 3"-5"-exonucléase. Cependant, dans la sous-unité catalytique de 182 kDa de l'ADN polymérase ? Drosophile, une 3'-5'-exonucléase a été trouvée, qui n'est active que lors de la dissociation de la sous-unité de 73 kDa.

Forme multiprotéique de l'ADN polymérase ? contient également une protéine qui se lie au dinucléotide diadénosinetétraphosphate (Ap 4 A). On suppose que Ap 4 A est impliqué dans la réplication de l'ADN et la division cellulaire. Existe-t-il des données sur la capacité de l'ADN polymérase ? utiliser Ap 4 A comme apprêt. Cependant, la participation d'Ap 4 A comme amorce in vivo est peu probable ; elle est plutôt utilisée comme effecteur. Fait intéressant, la tryptophanyl-ARNt synthétase, qui synthétise ce dinucléotide, est située dans le même complexe multiprotéique.

Généralement un complexe primase-polymérase ? se compose de quatre sous-unités : une grande sous-unité avec un poids moléculaire de 180 kDa, ou une famille de polypeptides de tailles allant de 140 à 160 kDa ; sous-unités avec un poids moléculaire d'environ 68 à 70 kDa et deux petites sous-unités avec des poids moléculaires de 54 à 58 et 46 à 50 kDa. La sous-unité p180 est responsable de la fonction polymérase. L'activité primase est associée à deux petites sous-unités. Dans le même temps, la sous-unité de 48 kDa est catalytique et réalise directement l'amorçage de l'ADN, tandis que la sous-unité de 58 kDa est impliquée dans la liaison du nucléotide purique initiateur et dans la fixation de la sous-unité p48 à l'ADN polymérase ?. Cela affecte également la vitesse de polymérisation et la stabilité du produit synthétisé par la sous-unité de 48 kDa. p58 facilite également l'entrée de p48 du cytoplasme vers le noyau. La sous-unité p180 interagit directement avec p58.

La sous-unité de 68 à 70 kDa est associée à la sous-unité catalytique et est nécessaire au transport du polypeptide catalytique dans le noyau cellulaire. La sous-unité 68-70 kDa est-elle également impliquée dans la régulation des niveaux d’ADN polymérase ? dans la cellule, il stimule la synthèse du polypeptide catalytique. Bien que le complexe ADN polymérase-primase soit constitué de quatre sous-unités, la composition quantitative de ce complexe peut être différente. Peut-être la polymérase ? et la primase se trouvent dans « l'écorce » dans un rapport de 1:3.

4.3.1.4. Réaction d'amorçage

L'initiation de la réplication et la synthèse discontinue de l'ADN sur le brin en retard se produit selon le mécanisme de l'amorce de l'ARN et constitue une propriété universelle de la réplication de l'ADN chez les pro- et les eucaryotes.

L'ADN primase diffère des autres ARN polymérases par un certain nombre de ses propriétés uniques. Premièrement, la spécificité de la matrice et du substrat. Deuxièmement, une processivité inhabituelle - la synthèse de multimères qui sont des multiples de liaisons de 10 nucléotides. Troisièmement, la faible précision et la résistance à certains inhibiteurs des ARN et ADN polymérases. Il faut ici revenir au problème de la synthèse des amorces ARN. La synthèse des amorces d'ARN sur des matrices naturelles commence dans des sites multiples, mais non aléatoires ; son initiation se produit avec l'ATP ou le GTP, même à des concentrations élevées de CTP et d'UTP. Il a été démontré que, par exemple, l'ADN du virus SV40 contient des sites d'initiation préférés, 3'-dCTTT ou 3'-dCCC, situés dans des régions de 7 à 25 nucléotides pyrimidine. Un rapport ATP/GTP élevé augmente la probabilité d'initiation dans les régions 3'-dCTTT, et une faible dans les régions 3'-dCCC. Ainsi, la concentration de NTP et la séquence nucléotidique de la matrice déterminent les sites d'initiation. Cependant, les sites d'initiation in vivo diffèrent nettement des sites d'initiation utilisés lors de la réplication de l'ADN du SV40. Dans de nombreux cas, la séquence 5"-YYYYYYYYCTTTYYYY-3" a été trouvée, où Y = C ou T, qui est la rampe de lancement pour l'initiation de la synthèse par l'ADN primase dans le cadre d'un complexe avec l'ADN polymérase ?. La longueur minimale du cluster de pyrimidine doit être d'au moins 7 nt. La substitution de l'une des pyrimidines à l'extrémité 3' du cluster réduit considérablement la fréquence d'initiation, tandis que les substitutions à l'intérieur et à l'extérieur du cluster entraînent un déplacement du point de départ. On sait que l'ADN primase elle-même reconnaît la matrice. ).

Ce complexe a une autre fonction spécifique : la synthèse du brin d'ADN télomérique en retard chez les mammifères est réalisée par l'ADN polymérase β-primase.

L'ADN primase est une enzyme relativement lente. Le taux moyen d'incorporation de NTP par cette enzyme est environ deux ordres de grandeur inférieur au taux d'incorporation de dNTP par l'ADN polymérase ?. ADN polymérase ? capable d'étendre les amorces de plus de 7 à 10 nt. Produits de 2 à 6 pb de long. ne sont-ils pas des substrats de l'ADN polymérase ? et sont dits abortifs, Avant la synthèse de l'amorce ARN, l'ADN polymérase ? et DNA primase agissent de manière indépendante, puis leurs activités sont coordonnées. L'amorce d'ARN synthétisée se déplace dans le centre actif de la polymérase sans se dissocier en solution. Ce mouvement intramoléculaire de l'amorce en duplex avec la matrice est rapide et comparable en vitesse à la synthèse de l'amorce. Après l’ADN polymérase ? allonge l'amorce, la primase commence la synthèse d'une nouvelle amorce et le cycle se répète. L'ADN primase eucaryote diffère des autres ARN polymérases par sa capacité à incorporer un désoxyribonucléotide dans une amorce, et la primase procaryote a la même propriété. L'une des explications possibles de la nécessité d'inclure le dNTP à l'extrémité 3' de l'amorce est la nécessité de passer de la forme A à la forme B de l'ADN. Par conséquent, comprendre le mécanisme de « commutation » de l'ADN Le complexe polymérase?-primase de la synthèse de l'ARN à l'ADN est d'une grande importance. La capacité des primases à reconnaître simultanément les ribo- et les désoxyribotriphosphates présente un intérêt scientifique sérieux.

Le choix de l’amorce ARN est déterminé par la nature hydrophobe des interactions protéine-acide nucléique. Dans le cas d'un hybride ARN-ADN, le duplex est sous la forme A, ce qui assure un équilibre optimal entre les interactions hydrophobes et complémentaires des bases de la matrice et de l'amorce.

Après l'initiation, la croissance de l'amorce s'accompagne de l'extraction de bases matrices de la cavité hydrophobe de la protéine pour l'appariement avec les bases du brin d'ARN en croissance. Dans des conditions de telle compétition, les di- et trinucléotides courts se dissocient facilement, formant des produits abortifs. À mesure que la longueur de l'amorce augmente, la résistance du duplex augmente, l'influence de l'hydrophobie du site actif s'affaiblit et les paires de bases se rapprochent de l'axe de l'hélice. Avec une longueur d'amorce de 7 n, les conditions sont créées pour l'inclusion d'un désoxynucléotide et la transition vers une forme B énergétiquement plus favorable. Ici, il faut tenir compte de la plus grande affinité pour l'enzyme dNTR par rapport au NTP. Le concept proposé est apparemment de nature universelle, puisque cela se produit également lors de l'initiation de la transcription.

ADN polymérase ? lie d'abord le modèle, puis l'apprêt et le substrat. ADN polymérase ? est plus actif sur l'ADN double brin contenant des lacunes d'au moins 20 à 30 nt de long. Région de liaison à la matrice avec l'ADN polymérase ? est assez long. Il protège fortement contre l'hydrolyse du brin d'amorce de 9 n, de la région double brin de 13 nt et de la matrice simple brin de 14 nt, et protège faiblement quelques bases en dehors de cette région. L'enzyme se lie à la matrice 19-20 n via des interactions ioniques et hydrophobes, l'efficacité de liaison dans ce cas est en corrélation avec l'hydrophobicité des bases de la matrice.

Quelle est la caractéristique de l’ADN polymérase ? est sa capacité à allonger les amorces d'ARN et sa forte association avec l'ADN primase, qui synthétise ces amorces.

Processivité moyenne de l'ADN polymérase ? est de 20 à 50 n. Primase fait rarement une erreur au moment de la synthèse des dinucléotides, mais utilise alors facilement le mauvais NTP. Bien que le taux d'incorporation de nucléotides erronés dépende de la séquence nucléotidique de la matrice et du nucléotide erroné lui-même, en principe, l'ADN primase est l'enzyme de polymérisation de nucléotides la plus imprécise. Dans certains cas, un nucléotide incorrect est inférieur à 100 corrects. L’insertion d’un nucléotide incorrect n’empêche pas l’inclusion du prochain nucléotide correct. La primase peut polymériser des nucléotides similaires et générer des amorces comportant de multiples erreurs qui n'inhibent pas la synthèse ultérieure et, après transfert intramoléculaire vers le site actif de l'ADN polymérase, sont étendues par l'ADN polymérase en présence de dNTP.

Il existe deux modèles de mécanisme de synthèse d'amorces qui ne sont pas complémentaires du modèle. Selon le premier modèle, l’enzyme comprend simplement des nucléotides qui ne sont pas complémentaires de la matrice. Le deuxième modèle implique l'inclusion d'un nucléotide complémentaire à la matrice, suivi d'un glissement de l'amorce par rapport à la matrice. La faible précision de l’ADN primase a servi de base à l’hypothèse selon laquelle l’ARN est la graine de la réplication de l’ADN. Étant donné que les premiers nucléotides peuvent être inclus par erreur dans le nouveau brin en croissance, on suppose que l'amorce d'ARN marque le site « hautement trompeur » pour une excision ultérieure et une construction plus précise. Ce point de vue semble convaincant, mais, probablement, la principale raison de l'apparition de l'amorce ARN est toujours associée à une initiation plus efficace de la synthèse de l'ADN en présence de la forme A du duplex ARN-ADN.

Contrairement à la primase, l'ADN polymérase ? est une enzyme assez précise. Elle fait en moyenne entre 1/30 000 et 1/50 000 erreurs. Les facteurs de réplication protéique jouent un rôle important pour garantir la spécificité de la synthèse. En présence de RPA, la précision de l’ADN polymérase ? se lève. On sait que la différence entre les énergies libres de formation des paires de bases correctes et incorrectes dans le centre actif de la polymérase est apparemment 10 fois plus grande que dans un milieu aqueux.

Formes d’ADN polymérase à haut poids moléculaire isolées des cellules ? peut avoir des activités autres que l’ADN polymérase et la primase. Ces complexes sont des fragments de la machine réplicative des cellules. Dans le complexe qui réplique le brin principal, l'ADN polymérase ? associé à l'ADN polymérase ?, et dans le complexe synthétisant le brin retardé, à l'ADN polymérase ?. Chez les eucaryotes, les deux complexes sont probablement connectés l'un à l'autre dans la fourche de réplication, de la même manière que les holoenzymes de la synthèse des brins leader et retard sont connectées chez les procaryotes. Ceci est démontré par l'isolement à partir de cellules humaines de complexes appelés synthésomes et contenant des ADN polymérases ?, ? et?, ainsi qu'un certain nombre d'autres protéines réplicatives, notamment l'ADN primase, le facteur de réplication RFC, le PCNA, la poly(ADP-ribose) polymérase et l'ADN ligase I. De ce complexe de haut poids moléculaire, l'ADN hélicase A de poids moléculaire 90 kDa et 5" -> 3"-exonucléase avec une mol. pesant 47 kDa. Avec l'ADN polymérase ? la protéine P1 des cellules de souris, qui est un homologue de la protéine MC3 de levure, peut également être liée. Le complexe ADN polymérase-primase se dissocie au cours de la méiose.

Le grand antigène T du SV40 (et d'autres papovavirus) interagit avec les sous-unités p180 et p70 du complexe ADN polymérase-primase et recrute ce complexe dans ou Je virus. Lors de la réplication du papillomavirus, l'ADN polymérase ? associé à l’hélicase virale E1.

La régulation négative du complexe dans le cycle cellulaire dépend non seulement de la phosphorylation de p180, mais également de la phosphorylation de la sous-unité p68 par les kinases dépendantes de la cyclineA. Dans les cellules de levure, le complexe ADN polymérase-primase est associé à la chromatine dans les phases G1 et S du cycle cellulaire, mais pas G2/M. La liaison à la chromatine dépend de la déphosphorylation de la sous-unité de 86 kDa (homologue p70) à la fin de la mitose.

4.3.1.5. ADN polymérase ? Et?

ADN polymérase ? est un hétérodimère constitué d'une sous-unité catalytique d'une masse moléculaire de 125 à 130 kDa et d'une sous-unité de 48 à 55 kDa, nécessaire à la liaison au facteur de processivité de l'antigène nucléaire des cellules en prolifération (PCNA). La petite sous-unité est nécessaire à l'enzyme pour surmonter les barrières structurelles dans les matrices naturelles simple brin. En fait, une enzyme native peut être un tétramère contenant deux sous-unités de poids moléculaires de 125 et 55 kDa, et la sous-unité de 55 kDa est un facteur de dimérisation pour les holoenzymes réplicatives, comme la sous-unité ? dans l'ADN polymérase III E. coli. En l’absence de PCNA, d’ADN polymérase ? a une faible processivité sur de longues matrices simple brin, et en présence de PCNA, la processivité augmente de 10 à 100 fois. Avec l'aide de mutants par délétion, il a été découvert que dans l'ADN polymérase ? chez la souris, la région de 129 à 149 résidus d'acides aminés de la région N-terminale du polypeptide catalytique est responsable de la liaison du PCNA ; le domaine C-terminal est moins conservé et contient deux régions de liaison à l'ADN.

Holoenzyme ADN polymérase ? comprend le facteur de processivité PCNA et les facteurs RFC (facteur de réplication C) et RPA, il est assemblé sur le complexe amorce-matrice dans l'ordre suivant : d'abord, le RFC se lie à l'extrémité 3'-OH de l'amorce sur un seul élément. matrice d'ADN brin "recouverte" de la protéine RPA. Ensuite, en présence d'ATP, le RFC forme sur le duplex d'ADN adjacent à l'extrémité 3' de l'amorce une structure cyclique de trois molécules PCNA d'une masse molaire de 36 kDa chacune, et PCNA assure la fixation de l'ADN polymérase ? à l'extrémité 3' de l'amorce, complétant ainsi la formation d'une holoenzyme hautement processive.

Dans le PCNA lui-même, des sites responsables de la liaison aux sous-unités RFC et aux ADN polymérases ont été identifiés. En plus de l'ADN à la polymérase ? les résidus d'acides aminés 121 à 135 sont impliqués, formant une boucle entre les domaines PCNA.

Activité 3"->5"-exonucléase de l'ADN polymérase ? est également régulé par les facteurs qui composent l'holoenzyme. En l'absence de facteurs auxiliaires, l'activité 3'->5'-exonucléase de l'ADN polymérase ? est faible, mais en présence de protéine RPA, ainsi que d'ADN polymérase ?, il augmente de 8 à 10 fois. L'effet activateur du RPA sur l'activité 3'->5'-exonucléase est apparemment dû à la déstabilisation du complexe graine-matrice en présence de ce complexe protéique.

Synthèse de l'ADN polymérase ? dans le cycle cellulaire est régulé au niveau de la transcription. La quantité d’ARNm de l’enzyme et de la protéine atteint un maximum à la limite de phase G1/S. Dynamique de la synthèse de l’ADN polymérase ? dans le cycle correspond à la dynamique de l'ADN polymérase ?. Il est intéressant de noter que la synthèse du PCNA au cours du cycle cellulaire est en corrélation avec la synthèse de l'ADN polymérase ? ; cependant, la teneur en PCNA augmente régulièrement et reste élevée jusqu'à la limite de phase G2/M. ADN polymérase ? est une phosphoprotéine dont le degré de phosphorylation le plus élevé appartient à la phase S. Phosphorylation de la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase de 125 kDa ? Elle serait réalisée par la protéine kinase cycline-dépendante cdk2, spécifique de la phase G1. Il est intéressant de noter que la phosphorylation de la sous-unité catalytique n’affecte pas son activité enzymatique.

ADN polymérase ? l'humain contient deux polypeptides - catalytiques 261 kDa et 55 kDa. ADN polymérase ? la levure se compose de cinq sous-unités : catalytique 256 kDa et sous-unités 80, 34, 31 et 29 kDa. Sous-unité de l'ADN polymérase de 80 kD ? la levure est un homologue de la sous-unité de 55 kDa de l'enzyme des cellules de mammifères. Les activités enzymatiques, ADN polymérase et exonucléase 3'->5', sont associées à un polypeptide de haut poids moléculaire, dont le domaine N-terminal fournit les deux activités, et le domaine C-terminal est nécessaire pour contrôler l'entrée de la cellule. dans la phase S du cycle.

Une caractéristique de l’holoenzyme ADN polymérase ? est-ce que sa dépendance à l'égard des facteurs auxiliaires PCNA, RFC et RPA est moindre par rapport à l'holoenzyme de l'ADN polymérase ?. ADN polymérase ? capable d'allonger processivement la graine sur des matrices simple brin en l'absence de PCNA. En présence d'un ensemble complet de facteurs de réplication, la processivité de synthèse et l'efficacité de la liaison à l'ADN polymérase augmentent-elles ? avec des amorces. Il existe une idée selon laquelle sur les matrices d'ADN recouvertes de la protéine RPA, les facteurs PCNA, RFC et ATP forment un « complexe de reconnaissance de l'extrémité 3'-OH de l'amorce ». Le site de liaison de l'ADN polymérase dans la molécule PCNA ne coïncide-t-il pas avec le site de liaison de l'ADN polymérase ? Ceci est démontré par le fait que différentes formes mutantes de la protéine PCNA synthétisées par les souches rspa-79 et rspa-90 ne sont pas capables d'interagir avec les ADN polymérases α et β, respectivement. et dans le mutant rspa-90, l'ADN polymérase ?.

Une autre différence entre les holoenzymes ADN polymérase ? Et? réside dans les différents taux de synthèse de l’ADN. Dans des conditions optimales, le taux de synthèse de l'ADN par l'holoenzyme ADN polymérase ? environ un ordre de grandeur inférieur au taux de synthèse de l'ADN polymérase® par l'holoenzyme. Cette différence est due à la fonction différente des ADN polymérases dans la fourche de réplication. Une holoenzyme ADN polymérase ? effectue une synthèse rapide et processive du brin principal, en utilisant pour l'élongation la seule amorce synthétisée dans la région ori, et ne se dissocie qu'en arrivant à l'extrémité du réplicon, et plusieurs holoenzymes de l'ADN polymérase ? peut synthétiser simultanément des fragments d'Okazaki dans la zone d'Okazaki en étendant les amorces synthétisées par l'ADN polymérase β-primase au début de chaque fragment. Dans ce cas, un renouvellement rapide de l'ADN polymérase™ devrait se produire, accompagné d'une dissociation après l'achèvement de la synthèse du fragment et d'une association avec l'amorce du fragment suivant. Dans la synthèse de fragments de brins retardés, lorsque la concentration en amorce est élevée et que plusieurs fragments peuvent être synthétisés simultanément, le taux de polymérisation est moins important que la capacité à passer rapidement d'un fragment d'Okazaki à un autre.

ADN polymérase, ? et ?, ont une activité 3'->5'-exonucléase, qui remplit une fonction corrective lors de la synthèse de l'ADN, mais les taux d'erreur dans la synthèse des brins principaux et retardés diffèrent. Cela est dû au fait qu'une partie de l'ADN du brin en retard est synthétisée par l'ADN polymérase ?, qui est capable de synthétiser l'ADN avec un grand nombre d'erreurs.

4.3.1.6. ADN polymérase ?

Cette polymérase est localisée dans les mitochondries et sa fonction est associée à la réplication et à la réparation de l'ADNmt. Les ADN polymérases sont des hétérodimères constitués d'une grande sous-unité catalytique de 125 à 140 kDa, qui possède une activité d'ADN polymérase et d'exonucléase 3'->5', et d'une sous-unité auxiliaire de 35 à 50 kDa, dont la fonction est inconnue. Enzymes de réplication de l'ADNmt, l'ADN polymérase est codée par le génome nucléaire. La structure primaire de l'ADN polymérase est similaire à celle de l'ADN polymérase I. E. coli, en particulier dans la région des centres catalytiques, dans le domaine N-terminal 3'->5'-exonucléase et le domaine C-terminal polymérase.

Fin de l'essai gratuit.