Mecanisme de reglare a replicării acidului nucleic. Reglarea replicării ADN-ului în celulă

O analiză detaliată a mecanismelor moleculare de reglare a replicării ADN-ului depășește scopul cărții, așa că ne vom limita la câteva comentarii pe această problemă și vom discuta mai detaliat doar mecanismul de reglare a replicării la E. coli, inclusiv plasmide bacteriene, care este direct legată de funcționarea vectorilor plasmidii din celulele bacteriene.

Sinteza ADN-ului este strâns legată de alte procese care pregătesc diviziunea celulară, deoarece transferul informațiilor genetice necesare de la celulele părinte la celulele fiice este vital pentru celulele descendente. Prezența excesului de informații genetice afectează negativ viabilitatea celulei, în timp ce deficiența acesteia, rezultată din subreplicarea ADN-ului, duce la un efect letal din cauza absenței genelor vitale. Cu toate acestea, procesul de transfer al informațiilor genetice de la celulele părinte la celulele fiice la eucariote nu se limitează la simpla reduplicare a ADN-ului cromozomilor. Astfel, insectele multor specii se caracterizează prin prezența gigantului politen cromozomi care apar ca urmare a mai multor runde de replicare a ADN-ului cromatidelor originale, neînsoțite de divergența lor.

Politenizare cromozomii reprezintă o clasă mare de fenomene genetice asociate cu suprareplicarea selectivă ( animaţie) sau subreplicarea locilor genetici individuali ai eucariotelor. Un exemplu izbitor de acest fel este o modificare a numărului de gene de ARN ribozomal la animale. Amplificarea genelor ARNr în ovocitele amfibiene are loc prin formarea copiilor lor extracromozomiale (extracromozomiale) sub formă de molecule circulare de ADN ribozomal (r), care sunt replicate în continuare folosind mecanismul „inelului de rulare”. În acest caz, în fiecare celulă este amplificată doar una dintre sutele de repetări ADNr, astfel încât amplificarea ADNr-ului la o repetare suprimă cumva procesul de amplificare pe celelalte, iar toate repetările rezultate ale unui ovocit sunt identice, dar diferă de seturile de amplificare. ADNr al altor ovocite. Specificitatea strictă a stadiului și a țesuturilor, precum și amplificarea selectivă a unei singure repetări ADNr indică și în acest caz prezența unor mecanisme subtile de reglare a procesului de replicare.

Exemple tipice de creștere a numărului de gene datorită replicării lor selective sunt Mărire genele ARNr și modificările numărului de gene care determină rezistența celulelor la medicamente. În primul caz, pierderea unor gene ARNr la Drosophila ca urmare a ștergerii este însoțită de o restabilire treptată a numărului lor, în timp ce în al doilea caz, în celule în condiții de acțiune selectivă a unui medicament care este toxic pentru acestea, numărul de copii ale genelor necesare neutralizării acesteia crește. În special, aceasta este caracteristică genei dihidrofolat reductazei în prezența metotrexatului. Se sugerează că modificarea numărului de copii ale unor astfel de gene se bazează pe mecanismul de încrucișare inegală.

Replicarea cromozomilor bacterieni este strâns legată de metabolismul celular. De exemplu, frecvența de inițiere a noilor runde de replicare depinde de rata de creștere a celulelor bacteriene, iar celulele bacteriilor cu creștere rapidă pot conține cromozomi cu mai multe furculițe de replicare funcționale, deși replicarea unui cromozom bacterian necesită doar două, inițiate la o origine unică de replicare (ori) și divergentă în direcții opuse. Acest lucru permite bacteriilor, în condiții favorabile, să petreacă mai puțin timp generând decât pentru replicarea completă a cromozomului bacterian. Este evident că, pentru a menține o natură strict ordonată a replicării, trebuie să existe mecanisme subtile de reglare a replicării la nivelul inițierii unor noi runde. Astfel de mecanisme există de fapt.

Mecanismele cele mai bine studiate în prezent sunt mecanismele de reglare a sintezei ADN-ului la E. coli, inclusiv mecanismele de control al numărului de copii în plasmida mică E. coli ColE1, care vor fi discutate mai jos mai detaliat datorită importanței acestora. fenomene pentru inginerie genetică.

Replicarea are loc după ce celula trece de punctul de restricție sau START

Replicarea este reglată în etape și coordonată cu debutul mitozei

Replicarea are loc la punctele de inițiere, care pot avea o structură primară specială, o poziție specifică sau pot fi situate la anumite distanțe în ADN

Inițierea are loc numai în punctele permise capabile de replicare

După ce și-au îndeplinit funcțiile, punctele de origine de replicare nu pot fi reutilizate până la următorul ciclu.

Când celule au analizat starea mediului și au decis să intre în ciclul de diviziune, trec de punctul G1/S și încep replicarea ADN-ului. Cum se combină și activează celulele factorii necesari pentru replicarea ADN-ului? Ce mecanisme de control asigură că o celulă reproduce ADN-ul o singură dată și o singură dată într-un ciclu?

Deși nu este încă posibil să oferim răspunsuri complete la acestea întrebări, prin identificarea și analiza secvențelor de ADN cromozomial de drojdie capabile de replicare independentă s-au obținut multe informații despre procesul de replicare a ADN-ului în sine.Aceste secvențe din cromozom, numite secvențe de replicare autonomă (ARS), fac parte din originile replicării. . Punctul de inițiere sau origine (originea replicării) este regiunea secvenței ADN unde începe replicarea.

În drojdia în devenire, dar nu în majoritatea alte organisme, originile replicării sunt reprezentate de mici secvențe consensuale. La fuziunea drojdiei, aceste puncte ocupă regiuni mari de ADN bogate în perechi AD, dar nu diferă în nicio structură specială. La alte eucariote, originile de replicare sunt localizate aleatoriu, în conformitate cu distribuția proteinelor asociate nespecific cu ADN-ul în întregul genom.

Pentru a garanta oportunitatea duplicarea genomului, trebuie să existe un număr suficient de origini de replicare pe cromozom. În bacterii, este necesară o singură origine pentru replicarea unui singur cromozom circular, dar la eucariote, care au un genom mare distribuit pe mulți cromozomi liniari, trebuie să existe mai multe origini de replicare. În drojdia în devenire, a cărei dimensiune a genomului este de aproximativ 13 Mb, există aproximativ 400 de origini de replicare pe 16 cromozomi.

Acest lucru creează mai multe probleme legate de reglarea procesului de replicare. Funcționarea originilor de replicare trebuie să fie coordonată cu ciclul celular, astfel încât replicarea să înceapă numai în timpul fazei S. Trebuie să existe o încredere completă că replicarea sa încheiat înainte ca celula să intre în mitoză. Fiecare origine de replicare trebuie să funcționeze o singură dată pentru a se asigura că ADN-ul este replicat o singură dată pe ciclu.

De-a lungul ciclului celular, 0RC este asociat cu originea replicării pe cromozom.
Într-o perioadă scurtă de timp, de la mitoza târzie până la G1, proteinele care activează replicarea se leagă și de origine,
Cdc6 și Cdt1, care la rândul lor activează complexul hexameric MCM helicază (MCM2-7).
Acest pas finalizează îndepărtarea blocului de replicare și asamblarea pre-RC.

Puncte de plecare replicare leagă factorii necesari pentru a activa replicarea și a iniția sinteza ADN-ului. Inițierea replicării ADN-ului are loc numai în acele puncte care conțin factori legați și care sunt, prin urmare, clasificate ca puncte permise. Cu toate acestea, fiecare rundă de replicare a ADN-ului implică un set limitat de puncte de plecare potențiale prezente pe cromozomi. Mai mult, deoarece diferite puncte de pornire activate sunt activate la momente diferite, evenimentele de inițiere apar și la intervale de timp diferite. De exemplu, unele puncte sunt activate în faza S timpurie, în timp ce altele intră în această stare mai târziu.

Nu se știe ce stabilește acest lucru factorul timp, dar se pare că localizarea unei origini specifice de replicare pe cromozom determină momentul declanșării acesteia.

Pentru ca replicarea să înceapă, a complex pre-replicativ(pre-RC). Ca rezultat al studiilor genetice în drojdie și experimente biochimice pe extracte de ouă de Xenopus, a fost dezvăluită imaginea asamblarii pre-RC. Procesul începe cu legarea unui complex de șase proteine la ADN, care se numește complex de recunoaștere a originii (ORC). Acest complex marchează originea potențială a replicării, dar nu este suficient pentru activare. Acesta servește ca platformă pentru legarea a două proteine mai conservate: Cdc6, care aparține familiei AAA+ATPaze și Cdt1. (Multe proteine care au un domeniu ATPază utilizează energia ATP pentru a-și face munca.)

Apoi li se alătură complexul suportul minicromozomilor(complex de întreținere a minicromozomilor, MCM), care este o structură ineală constând din șase proteine înrudite, care aparțin, de asemenea, familiei mari de AAA+ATPaze. Complexele MSM sunt prezente în exces și se răspândesc dincolo de originea replicării. Odată ce MCM este atașat, ORC și Cdc6 devin componente dispensabile, iar pre-RC intră într-o stare capabilă de activare. Ordinea evenimentelor care au loc în timpul asamblarii pre-RC la originile replicării este reprezentată schematic în figura de mai jos.

Asamblare pre-RC limitat de intervalul dintre sfârșitul fazei M și faza S timpurie, ceea ce se explică prin următoarele motive. În primul rând, în celulă nivelul proteinei Cdc6 este controlat astfel încât să fie prezent doar în această perioadă de timp. În absența proteinei Cdc6, proteina MSM nu se leagă de originea replicării. În al doilea rând, în Metazoa, proteina Cdt1 este reglată negativ de o altă proteină, geminina, care îi blochează activitatea în toate perioadele, cu excepția ferestrei din G1. În cele din urmă, ansamblul pre-RC în sine este limitat de activitatea complexului mitotic CDK-ciclină.

Substraturile acestui complex sunt subunitățile ORC, Cdc6Și MSM. La fosforilare, Cdc6 este inactivat, iar fosforilarea proteinei MCM în faza S determină scindarea acesteia din ADN. Prin urmare, pre-RC se poate forma numai atunci când activitatea complexului CDK-ciclină este scăzută. Aceasta este caracteristică intervalului dintre nivelurile de activitate ridicată a complexului mitotic CDK-ciclină în faza M și în faza S, când crește din nou, promovând activarea originii replicării.

Cât punct începe replicarea trecerea de la starea pre-replicativă la cea replicativă? Această tranziție necesită formarea multor complexe proteice suplimentare, iar procesul este sub controlul a două kinaze, complexul CDK-ciclină și Cdc7-Dbf4 (DDK). Astfel, activitatea complexului CDK-ciclină coordonează procesele de replicare și ciclul celular. În acest caz, coordonarea poate fi atât negativă (prevenirea asamblarii pre-RC și, astfel, refuncționarea originilor de replicare), cât și pozitivă (promovarea activării originilor de replicare). Printre întrebările care așteaptă răspunsuri se numără întrebarea referitoare la substraturile kinazelor care promovează inițierea replicării.

Dacă complexe CDK-ciclină asigura coordonarea proceselor pe tot parcursul ciclului, apoi DDK actioneaza la nivelul punctelor individuale care initiaza sinteza ADN-ului. Cele mai cunoscute substraturi ale acestei kinaze includ proteinele MSM în sine. Interesant este că o mutație punctuală a genei Mcm5 elimină cerința pentru prezența DDK. Acest lucru sugerează că fosforilarea duce la o modificare a structurii proteinei MSM, care determină inițierea replicării. Cu toate acestea, datele disponibile indică faptul că aceste modificări sunt extrem de minore. Sunt prezentate procesele de control ale replicării ADN care implică CDK și DDK.

Probabil procesul de inițiere limitativ replicare la puncte de plecare separate este legarea proteinei Cdc45, care necesită atât complexul CDK-ciclină, cât și DDK. Legarea acestei proteine, care este însoțită de formarea unui complex suplimentar numit GINS, duce la derularea helixului ADN la punctul de plecare, datorită activării complexului MSM, care acționează ca o helicază. Astfel, MSM este convertit dintr-un factor de asamblare implicat în formarea pre-RC într-o enzimă helicază care face parte din complexul de alungire. Desfacerea dublei helix ADN la originea replicării duce la formarea ADN-ului monocatenar, care leagă o proteină RPA specifică, care aparține grupului de proteine care se leagă de ADN-ul monocatenar (proteine de legare a ADNss).

La randul lui, proteina RPA promovează legarea complexului primază/ADN polimerază alfa, care inițiază sinteza ADN-ului. Complexul MSM și Cdc45 se mișcă de-a lungul ADN-ului pentru a forma o furcă de replicare în expansiune, care formează un replizom mare care cuprinde în principal ADN polimeraza 6, mai degrabă decât polimeraza a. Procesele de inițiere ale replicării ADN-ului sunt prezentate în figura de mai jos. Punctele de control și sistemele de reparare a ADN-ului sunt implicate în menținerea funcționării replizomului și în protejarea ADN-ului din regiunea furcii de replicare împotriva deteriorării.

De îndată ce MSMîndepărtat de originea replicării, este considerat „utilizat” și nu poate fi reactivat până la sfârșitul următoarei faze M, până când pre-RC se formează din nou la origine. Pe măsură ce faza S progresează, MSM sunt îndepărtați din cromatină. Odată cu aceasta, în timpul mișcării furcii de replicare, se stabilesc legături care leagă cromatidele surori nou formate între ele înainte de debutul mitozei. Astfel, finalizarea fazei S este asociată cu formarea structurilor necesare pentru segregarea corectă a cromozomilor în mitoză, ceea ce indică formarea conexiunilor între diferitele faze ale ciclului celular.

Funcția originilor de replicare este, de asemenea, reglementată la nivelul întreg cromozomii. Este indicat să reamintim că într-o celulă, cu ajutorul nucleozomilor, aceasta este ambalată în cromatină, ceea ce îi impune o serie de restricții structurale. Această împrejurare poate influența organizarea temporală a replicării; de exemplu, nu toate originile în replicarea în faza S au loc în același timp. În unele cazuri, momentul relativ al activării originilor replicării poate fi determinat nu de punctul în sine, ci de locația sa pe cromozom. Punctele situate aproape de eucromatina activă din punct de vedere transcripțional inițiază mai devreme decât cele situate lângă heterocromatina inactivă din punct de vedere transcripțional, care inițiază de obicei în faza S târzie.

4.2.1.Inițierea replicării ADN-ului în E. coli și reglarea acesteia

Replicarea ADN-ului cromozomial în bacterii joacă un rol cheie în ciclul lor de viață. În timpul acestui proces, microorganismele își reduplică genomul, iar genomurile fiice rezultate sunt apoi transferate în celulele fiice. Precizia ridicată cu care bacteriile efectuează astfel de procese indică prezența unor mecanisme speciale pentru coordonarea și controlul lor.

^ Structura zonei de pornire a replicării oriC. Cromozomul E. coli conține un singur cromozom regiunea de origine a replicării(origine), numit oriC, la care are loc inițierea replicării (Fig. I.47, A). Dimensiunea regiunii minime a originii replicării care asigură replicarea autonomă a cromozomului este de 258 bp. (poziţia 11–268 din Fig. I.47). O comparație a structurilor primare ale originilor replicării diferitelor enterobacterii a arătat că secvențele lor sunt reprezentate de regiuni conservatoare scurte, care sunt intercalate cu segmente de ADN divergente, ale căror lungimi sunt totuși foarte conservate. Regiunile conservate s-au dovedit a fi site-uri de legare pentru proteinele reglatoare separate prin secvențe spacer. OriC conține cinci situsuri consensuale de legare a inițiatorului ADN-ului de 9 nucleotide (repetări non-palindromice), numite cutii ADN. În toate enterobacteriile, originile replicării conțin 9-14 situsuri GATC, pozițiile a opt dintre ele fiind conservate.

Pe partea stângă a oriC există o regiune bogată în AT care conține trei secvențe similare lungi de 13 nucleotide, fiecare începând cu GATC. Aici este de asemenea localizat clusterul AT, care, împreună cu secvența stângă de 13 nucleotide, formează regiunea helixului ADN instabil ( Element de desfășurare a ADN-ului). Această secțiune de ADN poate fi înlocuită fără pierderea funcției cu o compoziție de nucleotide similară, dar cu o secvență de nucleotide diferită.

OriC conține situsuri de legare pentru proteinele care îndoaie ADN-ul, IHF (factor gazdă de integrare) și FIS (factor pentru stimularea inversării). Ambele proteine par să ajute ADN-ul inițiator să desfășoare ADN-ul.

Proteina dimerică IciA, constând din subunități cu o masă moleculară de 33 kDa, se leagă în mod specific la repetările 13-mer bogate în AT. Funcția acestei proteine este necunoscută, la fel ca și funcția proteinei Rob, care interacționează în mod specific cu un situs de 26 de nucleotide din partea dreaptă a cutiei ADN a lui R4. ADN-ul din apropierea site-ului Rob prezintă o îndoire care este mai pronunțată în moleculele complet metilate de metiltransferaza Dam (vezi mai jos). Proteina asemănătoare histonelor H-NS interacționează cu un astfel de ADN complet metilat, al cărui situs de legare se suprapune cu site-ul Rob. Această interacțiune afectează funcționarea oriC.

Orez. I.47. Structura originii regiunii de replicare a cromozomului E. coli ( A) și schema de inițiere a replicării acesteia ( b)

HobH este o proteină care interacționează cu o catenă de ADN metilat la originea replicării (legarea originii hemimetilate)
^ Funcțiile proteinei ADN. Proteina ADN joacă un rol cheie în asamblare replizomi– un complex proteic multicomponent care realizează sinteza bidirecțională a ADN-ului. Proteina recunoaște originea replicării și atrage componentele proteice rămase ale replizomului la locul de asamblare.

^ Etapele inițierii sintezei ADN-ului pe oriC. Asamblare original complexîncepe cu interacțiunea proteinei ADN cu casetele ADN R1–R4 și M (vezi Fig. I.47, b). Pentru a finaliza cu succes etapele ulterioare ale ansamblării replizomului, proteina ADN trebuie să fie într-un complex cu ATP și să interacționeze cu supercoiled. oriC. Folosind un microscop electronic, complexul părinte este detectat ca o structură elipsoidală compactă care conține 20 de monomeri ADN, care acoperă oriC. Complexul inițial are o structură foarte ordonată.

În prezența ATP în concentrație mare (5 mM), complexul inițial este transformat în complex deschis. În acest complex, are loc derularea parțială a repetărilor de 13 nucleotide bogate în AT situate pe partea stângă. oriC. La 37° sau mai mare, singura proteină ADN poate media derularea ADN-ului. Formarea complexului deschis la temperaturi mai scăzute necesită participarea proteinei structurante HU sau a factorului de integrare bacteriană gazdă IHF. În complexul deschis, se găsesc mici secțiuni de ADN care se desfășoară pe partea dreaptă oriCîntre cutiile ADN R2 și R4, care sunt considerate locuri de aterizare a helicazei.

Proteina DnaB este o helicaza de replicare și intră într-un complex deschis pentru a se forma complexul de preamorsare I, interacționând cu regiuni monocatenar ale ADN-ului parțial neîmpletit. Astfel de situsuri sunt preparate de proteina ADN, care înlocuiește proteina SSB din situsurile corespunzătoare. DnaB intră în complexul I de preamorsare sub formă de hexameri care formează un complex cu șase monomeri DnaC, fiecare dintre care leagă o moleculă de ATP. În acest complex, activitatea helicazei a proteinei DnaB este blocată. Eliberarea de ADN din complex are loc ca urmare a hidrolizei ATP. Consecința acestui lucru este activarea helicazei DnaB și localizarea corectă a acesteia în complex. Combinația acestor evenimente transformă complexul I de preamorsare în complexul de preamorsare II.

Helicaza ar trebui să înceapă să funcționeze la începutul furcii de replicare din partea dreaptă oriC lângă cutiile DnaA R2, R3 și R4. Pentru a face acest lucru, trebuie să fie translocat de la locul intrării sale inițiale în complex până la originea replicării. Se presupune că translocarea este asociată cu eliberarea dependentă de ATP a proteinei DnaC din complex, care este însoțită de activarea helicazei.

ÎN complex de amorsare helicaza DnaB interacționează cu primaza DnaG, care joacă un rol cheie în asigurarea inițierii replicării în mod specific la oriC. Ambele enzime asigură cuplarea funcționării a două furci de replicare care se mișcă în direcții opuse. Într-un sistem fără celule, la concentrații scăzute de primază, replicarea devine unidirecțională și poate să nu inițieze la oriC. În complexul de amorsare, prezența proteinei ADN nu mai este necesară și, după eliberarea din complex, aceasta poate fi reutilizată pentru a iniția replicarea pe altul. oriC. Se crede că în timpul asamblării coordonate a două furci de replicare, într-una dintre ele este sintetizat un primer, care devine primerul pentru sinteza catenei conducătoare printr-o altă furcă de replicare care se mișcă în direcția opusă. Primaza din complexul de amorsare funcționează conform unui mecanism distributiv. După sinteza primerului, acesta părăsește furculița de replicare și este înlocuit cu o nouă moleculă de primază în timpul formării următorului fragment Okazaki.

În timpul formării unui replizom, are loc o formare dependentă de ATP a unui complex dimeric al holoenzimei ADN polimerază III la fiecare furcă de replicare, asociată cu capetele de 3" ale primerilor (clemă de alunecare, vezi mai sus). Aceasta este urmată de alungire coordonată. de primeri, însoțită de sinteza bidirecțională a catenelor de ADN conducătoare și întârziate.Într-un sistem fără celule, punctele de plecare pentru sinteza catenelor conducătoare sunt localizate în oriC lângă cutiile DnaA R2, R3 și R4.

^ Mecanisme de control al inițierii replicării in vivo. Inițierea replicării ADN-ului în E. coli este reglată la cel puțin trei niveluri: 1) inițierea este sincronizată cu ciclul celular; 2) sinteza ADN-ului în fiecare regiune a originii replicării în ciclul celular este inițiată o singură dată; 3) inițierea are loc sincron în toate regiunile de origine a replicării prezente într-o celulă bacteriană dată. S-a stabilit că sinteza ADN-ului începe după ce masa unei celule bacteriene per o regiune a originii replicării atinge o anumită valoare numită masa de iniţiere(masa de inițiere). Proteina ADN este considerată în prezent ca principalul stimulator cardiac (pacemaker), jucând un rol cheie în controlul inițierii replicării.

Suprimarea sintezei proteinelor in vivo este însoțită de finalizarea sintezei ADN deja inițiate pe fondul încetării noilor runde de inițiere. Reluarea sintezei proteinelor duce la inițierea replicării după o perioadă de întârziere a unei singure generații de celule. În prezența tuturor proteinelor necesare, inițierea este sensibilă la rifampină, un inhibitor specific al ARN polimerazei bacteriene, ceea ce indică dependența inițierii de sinteza ARN-ului netradus.

Rolul topologiei oriC în inițierea replicării . Topoizomeraza I și topoizomeraza II (ADN-girază) mențin cromozomul bacterian într-o stare supercoilată negativ. Aproximativ jumătate din supraînfăşurare este neutralizată de proteinele asemănătoare histonelor HU, IHF şi FIS, în timp ce supraînfăşurarea rămasă a cromozomului bacterian facilitează transcripţia, replicarea şi recombinarea specifică locului. Se crede că cromozomul bacterian este alcătuit din 40-50 de domenii supercoilate cu ~ 25 supercoils per kb. ADN. În prezent nu există date precise despre starea topologică oriC, necesare pentru inițierea replicării în E. coli. Se știe că mutațiile genei topoizomerazei topA suprima mutațiile sensibile la temperatură dnaA(Ts). Se presupune că în aceste tulpini mutante topologia oriC modificat în așa fel încât să permită inițierea replicării la concentrații intracelulare mai mici ale proteinei ADN. În plus, importanța unei anumite stări topologice oriC pentru inițiere indică faptul că inițierea este perturbată în bacteriile mutante cu o genă alterată gyrB(Ts), care codifică subunitatea B a ADN-girazei.

Activarea replicării prin transcripție. În cazul în care supraînfăşurarea minicromozomilor sau plasmidelor care conţin oriC, nu este suficient pentru a iniția replicarea lor; inițierea poate avea loc cu transcrierea simultană a ADN-ului în vecinătate oriC. Schimbarea topologiei oriCîn acest caz se poate realiza prin educaţie R-bucle(hibrid ADN-ARN în ADN dublu catenar) sau datorită transcripției ca atare, în care are loc supraînfăşurarea pozitivă locală a ADN-ului înaintea ARN polimerazei de transcriere, urmată de supraînfăşurarea negativă. Acest lucru facilitează formarea de complexe deschise în timpul inițierii sintezei ADN.

^ Rolul proteineiDnaAîn reglementarea iniţierii replicării. Este nevoie de aproximativ 60 de minute pentru ca bacteriile să reproducă ADN-ul cromozomial, să separe cromozomii fiice și să se pregătească pentru o nouă diviziune. În consecință, celulele cu un timp de generare mai scurt decât această perioadă (de exemplu, la temperaturi ridicate în medii nutritive bogate) trebuie să inițieze replicarea cromozomilor destinați diviziunilor ulterioare înainte de finalizarea rundei anterioare de replicare. Astfel, o singură celulă poate conține un cromozom de replicare cu origini multiple de replicare. În acest caz, inițierea replicării la mai multe origini de replicare are loc simultan.

Supraproducția de ADN în bacterii duce la o creștere bruscă a frecvenței inițierilor de replicare fără a modifica rata generală a sintezei ADN, ceea ce indică ADN ca un regulator pozitiv al acestui proces. Dintre modelele care explică mecanismul acțiunii de reglare a proteinei ADN, modelul de titrare a ADN-ului este cel mai utilizat. Conform acestui model, toată proteina ADN nou sintetizată este legată (titrată) de cutiile ADN oriC cromozomii. De îndată ce numărul de molecule inițiatoare depășește numărul de cutii ADN intracelulare (toate cutiile ADN sunt ocupate de proteină), sinteza ADN este inițiată. După ce a început iniţierea pe una oriC există o eliberare de molecule de ADN, o creștere bruscă a concentrației sale intracelulare și inițierea sincronă a sintezei ADN în alte regiuni accesibile ale originii replicării. Mai mult, asocierea cu membrane este prima oriCîl protejează împotriva utilizării la reiniţiere.

Rolul metilării Dam în inițierea sintezei ADN. După cum s-a menționat mai sus, E. coli Dam metiltransferaza modifică reziduurile de adenină din secvențele 5"-GATC. Ca rezultat al replicării, molecula de ADN se transformă temporar dintr-o moleculă complet metilata într-una cu o singură catenă metilată, ceea ce permite celulei să recunoască nou. ADN sintetizat.Locația clusterelor de Dam este site-uri în oriC enterobacterii sunt extrem de conservatoare (vezi Fig. I.47, A). ADN-ul plasmidic nemetilat sau semimetilat nu se reproduce în celulele mutante, deși servește ca substrat în sistemul de replicare fără celule. Replicarea ADN-ului cromozomial la mutanții-mamă începe la oriC, cu toate acestea, controlul replicării este întrerupt, ceea ce se manifestă prin replicare asincronă pe multiple oriC. S-a dovedit că doar pe jumătate metilat, dar nu complet metilat sau nemetilat oriC- ADN-ul se leagă în mod specific de fracțiunea de membrană a E. coli in vitro. Mai mult, în celulele cu creștere rapidă 1/3 din timpul de generare oriC- ADN-ul este într-o stare semimetilată, după care devine complet metilat. Același lucru este valabil și pentru promotorul genei inițiatoare DnaA, în care starea semimetilată este asociată cu suprimarea transcripției genei. În schimb, remetilarea catenei de ADN nou sintetizată a restului cromozomului bacterian are loc rapid - în 1-2 minute. Pe baza acestui tip de date, se sugerează că, într-o stare incompletă de metilare, secvențele menționate mai sus sunt protejate de membranele bacteriene de contactele cu proteinele reglatoare și nu pot participa la a doua rundă de inițiere a replicării (perioada). eclipsă). Mutații în genă secA reduce brusc timpul de eclipsă, care se manifestă prin asincronia inițierilor de replicare. Proteina SeqA s-a dovedit a fi un regulator negativ al inițierii replicării, acționând în stadiul de interacțiune oriC cu membrane bacteriene.

^ Rolul proteinei SeqA în reglarea replicării cromozomilor bacterieni. Gene secA codifică o proteină cu 181 de resturi de aminoacizi, a cărei inactivare este letală pentru celulele bacteriene. Un studiu al interacțiunii acestei proteine cu regiunile nemetilate, parțial și complet metilate ale originii replicării, utilizând metoda deplasării benzii în electroforeza pe gel de poliacrilamidă, a arătat legarea sa preferențială la secvențele parțial metilate. Cu toate acestea, pentru specificitatea completă (dependentă de context) a interacțiunii sale, este necesară prezența unor factori suplimentari. Într-adevăr, ca parte a complexelor ADN-proteină formate cu participarea unor secvențe parțial metilate oriC, a fost descoperită o proteină cu o greutate moleculară de 24 kDa care interacționează în mod specific cu catena de ADN metilat în oriC. Screening-ul bibliotecii de secvențe de E. coli a permis ca gena să fie donată hobH (legarea originii hemimetilate), care codifică această proteină. Mutațiile acestei gene au condus la o pierdere parțială a sincronizării în inițierea replicării în celulele bacteriene, ceea ce indică, de asemenea, indirect participarea proteinei HobH la reglarea inițierii replicării cromozomilor bacterieni în stadiile incipiente ale ciclului celular. Cu toate acestea, adevăratul rol al acestei proteine în replicare nu este complet cunoscut.

Perioada de eclipsă se poate încheia ca urmare a finalizării treptate a metilării unei secvențe parțial metilate. oriC, situat în complex cu membrane. Metilarea completă a acestor secvențe previne interacțiunea lor cu membranele și le face accesibile inițiatorului ADN.

^ Încetarea replicării. Întâlnirea a două furcuri de replicare la sfârșitul ciclului de replicare al unui cromozom bacterian este însoțită de mai multe evenimente care sunt necesare pentru separarea completă a celor doi cromozomi bacterieni rezultați înainte de diviziunea celulară. Mișcarea furcilor de replicare una către cealaltă este însoțită de recombinarea omoloagă între cromatidele fiice. Dacă numărul recombinărilor care au avut loc este impar, se formează un dimer al cromozomului bacterian, în timp ce dacă numărul recombinărilor este par, se formează doi cromozomi catenați (legați unul de celălalt). În al doilea caz, separarea catenanelor de către topoizomeraza IV duce la separarea completă a cromozomilor fiice, în timp ce în cazul unui dimer de cromozom bacterian acest lucru nu este suficient. Separarea dimerilor pentru a forma monomeri are loc ca rezultat al recombinării specifice locului la locus dif sub acţiunea rezolvazei (recombinazei site-specifice) XerCD.
^

4.2.2.Reglarea replicării plasmidei ColE1

Multe celule procariote conțin, pe lângă cromozomul principal, un mic ADN extracromozomial numit plasmide. Plasmidele, ale căror dimensiuni variază de la câteva mii la sute de mii de perechi de baze și numărul de copii pe celulă de la una la câteva sute, sunt capabile de replicare autonomă (independentă de cromozomul principal) și sunt moștenite stabil pe un număr de celule. generatii. Deși multe plasmide oferă celule gazdă avantaje selective semnificative (rezistență la antibiotice, metale grele etc.), cele mai multe dintre ele sunt criptic, adică nu se manifestă într-un fenotip celular vizibil. Deoarece existența lor pune o povară semnificativă asupra metabolismului celulelor gazdă, semnificația stabilității lor evolutive rămâne neclară. Deși, în condiții naturale, celulele bacteriene nu par să experimenteze presiune de selecție pentru a reține plasmidele în interiorul celulelor, acestea din urmă, prin mecanisme subtile care reglează numărul de copii ale acestora în celule, se segregează stabil între celulele bacteriene fiice.

Originea replicării micii plasmide ColE1, care poartă gene de rezistență la colicină, este utilizată în mod tradițional în inginerie genetică în construcția moleculelor de ADN vector, care sunt utilizate pentru donarea și exprimarea secvențelor scurte de nucleotide în celulele E. coli. De aceea este recomandabil să se ia în considerare mecanismele de control al replicării plasmidei ColE1.

^ Inițierea replicării plasmidei ColE1. Replicarea plasmidei ColE1 are loc într-o singură direcție (replicare unidirecțională) folosind aparatul de replicare a celulei gazdă. Plasmida în sine nu codifică nicio enzimă care ar fi necesară pentru replicarea sa. Regiunea de origine a replicării conține doi promotori, dintre care unul asigură sinteza primerului ARN (ARN II) necesar pentru inițierea replicării plasmidei. ARN II sintetizat, a cărui lungime depinde de tipul de plasmidă care este replicată, este procesat în continuare de RNaza H pentru a produce un ARN de 550 de nucleotide în lungime. Această moleculă este utilizată eficient de ADN polimeraza I ca primer în sinteza catenei principale de ADN. În absența RNazei H, capătul 3’ al ARN II servește ca primer în timpul replicării, deși cu o eficiență mai mică. În celulele cu deficit de RNază H și ADN polimerază, inițierea replicării ColE1 este efectuată de ADN polimeraza III cu participarea ARN II conform mecanismului discutat în detaliu mai sus.

Toate cele trei mecanisme de inițiere a replicării plasmidelor se bazează pe proprietatea unică a ARN II de a forma un hibrid stabil ADN-ARN la originea replicării. Într-adevăr, transcrierile obișnuite sunt eliberate din complexul de transcripție după finalizarea transcripției și separarea ARN polimerazei de șablon, ceea ce nu se întâmplă cu ARN II. Analiza mutanților plasmide cu defecte în replicare, precum și a revertanților acestora, a arătat că într-un hibrid stabil de ARN II cu matrița are loc interacțiunea între bucla bogată în G a ARN II, formată 265 de nucleotide în amonte de punctul de inițiere a replicării (poziția –265), și ADN-ul regiunii bogate în C situat în vecinătatea nucleotidei –20 (Fig. I.48, A). S-a constatat că ambele aceste secvențe sunt conservate printre plasmidele înrudite pMB1, p15A și KSF1030. Interacțiunile dintre aceste secvențe apar aparent într-un moment în care ARN polimeraza este încă în complexul de transcripție și lanțurile de ADN din vecinătatea complexului sunt nețesute. Echilibrul dintre cele două conformații alternative ale ARN II este critic în determinarea proporției de molecule de ARN rămase în hibridul ADN-ARN necesar pentru a iniția replicarea plasmidei. Alegerea dintre două conformații alternative ale ARN II este determinată de structura primară a regiunii situate între nucleotidele –359 și –380 (secvența ) (vezi Fig. I.48, b). Această secvență poate interacționa cu o secvență complementară în amonte  (structura ) sau cu o secvență omoloagă  situată dedesubt (structura ). După ce ARN polimeraza transcrie primele 200 de nucleotide, ARN-ul II rezultat formează o structură secundară temporară caracterizată prin trei domenii stem-loop (I, II și III). Extinderea ARN II cu încă câteva nucleotide duce la distrugerea tulpinii III și formarea tulpinii IV, care se stabilizează ca urmare a interacțiunilor complementare dintre secvențele  și . În timpul alungirii ulterioare a ARN II, acesta are două oportunități alternative de a-și forma structura secundară. Alegerea în favoarea unei conformaţii sau alteia depinde dacă secvenţa  rămâne asociată cu secvenţa  sau formează noi contacte cu secvenţa . Trecerea de la perechile complementare  la  este însoțită de schimbări puternice în conformația ARN II, care determină în cele din urmă capacitatea acestuia de a servi ca primer în timpul replicării plasmidei. Moleculele de ARN II din conformația  pot forma un hibrid ARN-ADN, care servește ca substrat pentru RNaza H, dar în conformația  nu au această capacitate. Modelul propus este confirmat, în primul rând, de faptul că mutațiile care favorizează formarea conformației  datorită destabilizarii tulpinii IV împiedică funcționarea ARN II ca primer și conduc la scăderea numărului de copii ale plasmida ColE1 din interiorul celulelor bacteriene. Astfel de plasmide mutante cu defecte de replicare sunt activate ca rezultat al mutațiilor supresoare care stabilizează tulpina IV. Astfel, inițierea replicării plasmidei ColE1 depinde de capacitatea ARN II de a forma un hibrid ARN-ADN aproape de originea replicării (ori). În acest caz, formarea hibridului este influențată de structurile secundare și terțiare din amonte de secvența de nucleotide a precursorului primerului.

^ Orez. I.48. Schema de reglare a replicării plasmidei ColE1

A– structura secundară presupusă a ARN II, după transcrierea a  500 de nucleotide de ADN plasmidic de către ARN polimerază; alungirea ulterioară a ARN II este însoțită de formarea unui hibrid ADN-ARN (săgeată groasă) între ARN II și ADN-ul transcris;

b– un posibil mecanism de control al replicării plasmidelor. Partea superioară a figurii prezintă o hartă genetică a regiunii ADN necesară pentru inițierea și controlul replicării ADN-ului plasmid. Structurile spațiale a doi inhibitori de replicare a plasmidei: ARN I și proteina Rop sunt prezentate schematic. Partea inferioară prezintă două conformații alternative de ARN II, formate sub influența ARN I, I–X - elemente ale structurii secundare
^ Controlul numărului de copii ale plasmidei ColE1. Controlul inițierii replicării plasmidei ColE1 se realizează în principal la nivelul modificărilor structurii spațiale a ARN II. Deoarece plasmidele își controlează propria biosinteză, de ex. replicarea lor are loc printr-un mecanism autocatalitic, s-a postulat că inițierea replicării ColE1 este influențată de un inhibitor codificat plasmid, a cărui concentrație în celulă este mai mare, cu atât este mai mare numărul de copii intracelulare ale plasmidei. Într-adevăr, analiza mecanismelor de replicare a plasmidelor mutante, care sunt caracterizate de un număr mare de copii, a făcut posibilă identificarea a două transă- factori activi codificați de plasmidă și care influențează replicarea plasmidei in vivo.

Principalul inhibitor al replicării s-a dovedit a fi un ARN mic de 108 nucleotide lungime, numit ARN I, complet complementar cu secvența 5’-terminală a precursorului primerului (ARN II). Promotorul genei ARN I este situat în regiunea originii replicării plasmidei ColE1 și este direcționat în direcția opusă promotorului ARN II (vezi Fig. I.48). Interacțiunile complementare dintre ARN I și ARN II influențează formarea structurii spațiale a ARN II în așa fel încât să apară în mod preferențial conformația βγ, inactivă față de inițierea replicării (vezi Fig. I.48, b, dreapta-jos).

Interacțiunea dintre ARN I și ARN II are loc productiv doar atâta timp cât este sintetizat un scurt transcript ARN II de cel mult 80 de nucleotide. Deși interacțiunea ARN I cu o secvență atât de scurtă de nucleotide are loc mai lent decât cu o transcriere lungă de 360 de nucleotide, în ultimul caz ARN I nu afectează conformația părții 5’-terminale a ARN II și capacitatea sa de a funcționa ca primer în timpul replicării plasmidei (conformația αβ, Fig. I.48, b, stânga jos). Din aceasta rezultă clar că rata de formare a hibrizilor între ARN I și ARN II este decisivă pentru funcționarea eficientă a mecanismului de reglare a replicării plasmidei. Procesul de interacțiune dintre ARN I și ARN II a fost acum studiat în detaliu. Trece prin formarea mai multor produși intermediari și se termină cu producerea unui hibrid stabil între ARN I și regiunea 5’-terminală a ARN II, care sunt complet complementare între ele.

^ Proteina organizatoare de ARN Rop. Gena pentru a doua componentă, care reglează negativ replicarea plasmidei ColE1, este mapată direct în aval de regiunea de origine a replicării. Această genă codifică o proteină 63-mer numită Rop (represor al primerului), care există în soluție ca dimer. Atât in vivo, cât și in vitro, Rop îmbunătățește activitatea inhibitoare a ARN-ului I fără a afecta sinteza ARN-ului II. În acest caz, Rop influențează fazele inițiale ale interacțiunii dintre ARN I și ARN II, facilitând tranziția produsului intermediar foarte instabil C* la cel mai stabil – Cm*. Proteina Rop are o afinitate mare pentru C* și interacționează doar slab cu ARN I și ARN II izolat in vitro. Se presupune că Rop prezintă o specificitate minoră a secvenței de nucleotide și recunoaște unele caracteristici structurale generale ale complexului ARN I-ARN II care apare în stadiile incipiente ale interacțiunii lor. Astfel, funcțiile proteinei Rop constau aparent în transformarea unui complex ARN-ARN instabil într-unul mai stabil, care, la rândul său, este însoțit de suprimarea formării primerului necesar pentru inițierea replicării plasmidei ColE1.

Utilizarea ARN-urilor antisens pentru a controla replicarea plasmidelor bacteriene este o tehnică comună. În special, replicarea plasmidei R1 mici, cu copii mici, este controlată de proteina RepA, care este implicată în inițierea replicării plasmidei ca factor regulator pozitiv. Sinteza RepA, la rândul său, este reglată posttranscripțional de către micul ARN antisens CopA, care se leagă de ARNm RepA într-o reacție în mai multe etape care amintește de formarea hibridă dintre ARN I și ARN II discutată mai sus. Această interacțiune suprimă expresia genelor repA, posibil din cauza clivajului duplexului ARN-ARN de către RNaza III. Concentrația intracelulară de ARN CopA antisens este direct proporțională cu numărul de copii ale plasmidei R1. Un mecanism similar a fost descris pentru reglarea inițierii replicării plasmidei Staphylococcus aureus pT181.

Atunci când se produc vectori bacterieni pentru inginerie genetică, dintre care mulți conțin originea replicării plasmidei ColE1, inhibitorii de biosinteză a proteinelor, în special cloramfenicolul, sunt adesea utilizați pentru a crește numărul de copii ale acestora în celulele bacteriene. După discutarea mecanismelor de reglare pentru controlul replicării acestei plasmide, devin clare principiile pe care se bazează această tehnică. Într-adevăr, adăugarea de cloramfenicol în mediul de cultură blochează biosinteza proteinelor bacteriene, inclusiv a proteinei Rop, care este necesară pentru suprimarea eficientă a inițierii replicării plasmidei sub influența ARN I. Ca urmare, controlul numărului de copii. plasmidele din celulele bacteriene este perturbată și acestea încep să se replice continuu folosind proteine bacteriene pre-sintetizate în acest scop.

Se știe că două plasmide fenotipic diferite care utilizează același mecanism de control al replicării sunt incompatibile în aceeași celulă bacteriană. Celulele care conțin două plasmide din grupuri de compatibilitate diferite formează rapid două populații în timpul reproducerii, fiecare dintre ele conține doar un singur tip de plasmidă. Acest lucru se întâmplă datorită selecției aleatoare a plasmidelor pentru replicare în celulele bacteriene și distribuției aleatorii a grupului inițial de plasmide între celulele fiice. Apariția evolutivă a unui mecanism de control al replicării plasmidelor bacteriene folosind ARN-uri antisens a extins posibilitățile de apariție a plasmidelor aparținând unor grupuri de compatibilitate diferite și care coexistă în aceleași celule bacteriene. Într-adevăr, în ciuda utilizării aceluiași mecanism, ARN-urile antisens cu secvențe de nucleotide diferite nu vor putea recunoaște ținte de ARN heterologe „străine”. Acest lucru permite ca astfel de plasmide să coexiste în aceeași celulă bacteriană și creează condiții pentru o distribuție mai largă a acestora în populațiile naturale de microorganisme.

Replicarea ADN-ului

Replicarea ADN-ului- procesul de sinteză a unei molecule fiice de acid dezoxiribonucleic pe matricea moleculei de ADN părinte. În timpul diviziunii ulterioare a celulei mamă, fiecare celulă fiică primește o copie a unei molecule de ADN care este identică cu ADN-ul celulei mamă inițiale. Acest proces asigură transmiterea cu acuratețe a informațiilor genetice din generație în generație. Replicarea ADN-ului este realizată de un complex enzimatic complex format din 15-20 de proteine diferite, numit engleză. replisome) .

Istoria studiului

Fiecare moleculă de ADN constă dintr-o catenă a moleculei părinte inițiale și o catenă nou sintetizată. Acest mecanism de replicare se numește semi-conservator. În prezent, acest mecanism este considerat dovedit datorită experimentelor lui Matthew Meselson și Franklin Stahl (g.). Anterior, existau alte două modele: „conservator” - ca urmare a replicării, se formează o moleculă de ADN, constând numai din lanțuri părinte și una, constând numai din lanțuri fiice; „dispersive” - toate moleculele de ADN rezultate din replicare constau din lanțuri, dintre care unele secțiuni sunt nou sintetizate, în timp ce altele sunt preluate din molecula de ADN părinte.

Vederi generale

Replicarea ADN-ului este un eveniment cheie în timpul diviziunii celulare. Este important ca până la momentul divizării ADN-ul să fi fost replicat complet și o singură dată. Acest lucru este asigurat de anumite mecanisme care reglează replicarea ADN-ului. Replicarea are loc în trei etape:

iniţierea replicării
elongaţie
terminarea replicării.

Reglarea replicării are loc în principal în stadiul de inițiere. Acest lucru este destul de ușor de implementat, deoarece replicarea poate începe nu de la orice secțiune de ADN, ci de la una strict definită, numită situl de inițiere a replicării. Pot exista fie doar unul, fie mai multe astfel de site-uri în genom. Strâns legat de conceptul de site de inițiere a replicării este conceptul replicon . Un replicon este o secțiune a ADN-ului care conține o origine de replicare și este replicată după ce începe sinteza ADN-ului din acest site. Genomul bacterian, de regulă, reprezintă un singur replicon, ceea ce înseamnă că replicarea întregului genom este o consecință a unui singur act de inițiere a replicării. Genomul eucariotic (precum și cromozomii lor individuali) constau dintr-un număr mare de repliconi independenți, ceea ce reduce semnificativ timpul total de replicare al unui cromozom individual. Mecanismele moleculare care controlează numărul de evenimente de inițiere a replicării la fiecare loc în timpul unui ciclu de diviziune celulară sunt numite control al numărului de copii. Pe lângă ADN-ul cromozomial, celulele bacteriene conțin adesea plasmide, care sunt repliconi individuali. Plasmidele au propriile mecanisme de control al numărului de copii: pot asigura sinteza unei singure copii a plasmidei pe ciclu celular sau a mii de copii.

Replicarea începe la locul de inițiere a replicării odată cu desfășurarea dublei helix ADN, care formează furcă de replicare - locul de replicare directă a ADN-ului. Fiecare site poate forma una sau două furcuri de replicare, în funcție de dacă replicarea este unidirecțională sau bidirecțională. Replicarea bidirecțională este mai frecventă. La ceva timp după începerea replicării, se poate observa la microscopul electronic ochi de replicare - o secțiune a unui cromozom în care ADN-ul a fost deja replicat, înconjurat de secțiuni mai lungi de ADN nereplicat.

La bifurcația de replicare, ADN-ul copiază un complex proteic mare (replizom), a cărui enzimă cheie este ADN polimeraza. Furca de replicare se mișcă cu o viteză de aproximativ 100.000 de perechi de baze pe minut la procariote și 500-5000 la eucariote.

Mecanismul molecular de replicare

Enzimele (helicaza, topoizomeraza) și proteinele care leagă ADN-ul desfășoară ADN-ul, mențin șablonul în stare diluată și rotesc molecula de ADN. Replicarea corectă este asigurată de potrivirea exactă a perechilor de baze complementare și de activitatea ADN polimerazei, care este capabilă să recunoască și să corecteze eroarea. Replicarea la eucariote este realizată de mai multe ADN polimeraze diferite. În continuare, moleculele sintetizate sunt răsucite conform principiului supraînfăşurării şi compactării ulterioare a ADN-ului. Sinteza este consumatoare de energie.

Catenele moleculei de ADN diverg, formează o furcă de replicare și fiecare dintre ele devine un șablon pe care este sintetizată o nouă catenă complementară. Ca urmare, se formează două noi molecule de ADN dublu catenar, identice cu molecula părinte.

Caracteristicile procesului de replicare

Note

Literatură

Conservarea ADN-ului de-a lungul generațiilor: replicarea ADN-ului (Favorova O.O., SOZH, 1996)PDF (151 KB)
Replicarea ADN (animație) (engleză)

Fundația Wikimedia. 2010.

Replicant (BeOS)
Repnikha

Vedeți ce înseamnă „replicarea ADN” în alte dicționare:

replicarea ADN-ului- - biosinteza noului ADN pe matricea ADN-ului matern... Un scurt dicționar de termeni biochimici

Replicarea ADN-ului- DNR biosintezė statusas T sritis chemija apibrėžtis Fermentų katalizuojama polinukleotidinė DNR sintezė și DNR matricos. atitikmenys: engl. Replicarea ADN-ului rus. Replicarea ADN-ului ryšiai: sinonimas – DNR replikacija… Chemijos terminų aiškinamasis žodynas

REPLICAREA- (din Late Lat. replicatio repetition), reduplicarea, autoreplicarea, procesul de auto-reproducere a macromoleculelor de acid nucleic, asigurarea copierii exacte a geneticii. informaţia şi transmiterea acesteia din generaţie în generaţie. În centrul mecanismului R.... Dicționar enciclopedic biologic

REPLICAREA- (din Late Lat. replicatio repetition) (autoreproducție, autosinteză, reduplicare), dublarea moleculelor de ADN (în unele virusuri ARN) cu participarea unor enzime speciale. Replicarea se mai numește și duplicarea cromozomilor, care se bazează pe replicare... Dicţionar enciclopedic mare

ADN- (acid dezoxiribonucleic), ACID NUCLEIC, care este componenta principală a CROMOZOMILOR celulelor eucariote și a unor VIRUSURI. ADN-ul este adesea numit „materialul de construcție” al vieții, deoarece stochează CODUL GENETIC,... ... Dicționar enciclopedic științific și tehnic

Replicare negestionată- * replicare neîntreruptă * replicare neîntreruptă replicare multiplă a ADN-ului plasmidic, care nu este asociată cu diviziunea celulară și nu este controlată de această diviziune... Genetica. Dicţionar enciclopedic

ADN- ADN dublu helix Acidul dezoxiribonucleic (ADN) este unul dintre cele două tipuri de acizi nucleici care asigură stocarea, transmiterea din generație în generație și implementarea programului genetic pentru dezvoltarea și funcționarea organismelor vii. Principal... ...Wikipedia

Replicare (biologie)

Replicare (citologie)- Reprezentarea schematică a procesului de replicare, numerele indică: (1) catenă întârziată, (2) catena conducătoare, (3) ADN polimerază (Polα), (4) ADN ligază, (5) Primer ARN, (6) ADN primază, (7 ) Fragment Okazaki, (8) ADN polimerază (Polδ), (9) ... ... Wikipedia

Spivak Irina Mihailovna

Replicarea ADN-ului

Introducere

Programul genetic al tuturor organismelor vii, cu excepția virusurilor ARN, este scris în secvența de nucleotide a ADN-ului. În consecință, pentru a păstra proprietățile unice ale organismului, este necesar să se reproducă cu acuratețe această secvență în fiecare generație ulterioară. E. coli, de exemplu, trebuie să dubleze practic fără erori întregul genom de 4.10 6 perechi de nucleotide în mărime în timpul formării fiecărei generații ulterioare; în același mod, aproape 4·10 9 perechi de baze din cele 23 de perechi de cromozomi umani trebuie copiate în timpul fiecărui act de diviziune celulară. Proprietatea principală a ADN-ului este că servește ca șablon și determină ordinea în care nucleotidele sunt aranjate în noi catene de polinucleotide.

Replicarea ADN-ului în sine în sens larg este un proces foarte important pentru o celulă în divizare. De asemenea, include pregătirea cromatinei pentru replicare și prevenirea mitozei repetate. Acest lucru asigură duplicarea ADN-ului o dată pe ciclu celular, menținând astfel stabilitatea genomului.

Stabilitatea genetică a organismelor vii este determinată în mare măsură de funcționarea complexului de proteine care realizează replicarea ADN-ului. Este clar că replicarea ADN-ului este reglată de o varietate de interacțiuni proteină-proteină și ADN-proteină, al căror mecanism rămâne necunoscut. În plus, complexul de replicare a ADN-ului funcționează în concordanță cu complexele proteice care repară deteriorarea ADN-ului. În același timp, procesul de transfer de informații de la un organism părinte la un organism fiică este însoțit de recombinarea moleculelor de ADN pentru a crea o diversitate ereditară mai mare. Procesul de recombinare a ADN-ului este descris în detaliu în timpul încrucișării meiotice în timpul formării celulelor germinale, în timpul recombinării V(D)J - procesul de formare a diferitelor gene de imunoglobuline și receptori de imunoglobuline și în timpul acțiunii anumitor sisteme de reparare a ADN-ului. Având în vedere toată diversitatea și consistența proceselor de metabolizare a ADN-ului, putem presupune o diversitate și mai mare și o interacțiune complexă a complexelor proteice care realizează reproducerea stabilă a materialului ereditar de-a lungul generațiilor.

Este important să ne dăm seama că ADN-ul codifică informații despre mecanismul propriei duplicări: unele gene codifică enzime care sintetizează precursori de nucleotide ADN, altele codifică proteine care asambla nucleotidele activate în lanțuri de polinucleotide. Există gene care coordonează procesul de replicare cu alte evenimente celulare, precum și gene care codifică proteine care împachetează ADN-ul în cromatină.

Înțelegerea reglementării și dinamicii acestor sisteme este o provocare cheie în biologia moleculară a secolului XXI.

Capitolul 1. Replicare - reacția polimerazei

Când James Watson și Francis Crick și-au publicat modelul de structură a ADN-ului în 1953, ei au scris: „Nu ne-am putut abține să nu realizăm că împerecherea de baze specifică pe care am postulat-o implica prezența unui mecanism de copiere a materialului teist.” Ei au fost primii care au remarcat: „Dacă se știe ordinea exactă a bazelor dintr-unul dintre lanțuri, atunci ordinea bazelor din celălalt poate fi scrisă, deoarece împerecherea bazelor este specifică. Astfel, un lanț este complementul celuilalt; această proprietate sugerează că ADN-ul se poate duplica singur.”

Watson și Crick au propus că pentru ca ADN-ul să se dubleze, legăturile de hidrogen care țin împreună duplexul elicoidal trebuie să fie rupte, iar firele trebuie separate. Ei au sugerat, de asemenea, că fiecare catenă a duplexului servește ca șablon pentru sinteza catenei complementare și, ca urmare, se formează două perechi de fire, în fiecare dintre care doar unul este părintele. Acesta este mecanismul de reproducere cu acuratețe a secvenței perechilor de nucleotide din dubla helix ADN. Watson și Crick credeau că replicarea ADN-ului are loc spontan, fără participarea enzimelor, dar acest lucru s-a dovedit a fi incorect. Totuși, ideea că duplicarea ADN-ului are loc prin combinarea nucleotidelor în secvență conform regulii de complementaritate specificată de fiecare catenă a helixului a rezolvat problema conceptuală a reproducerii precise a genelor.

Conform modelului general acceptat, replicarea întregului ADN dublu catenar este semi-conservativă. Nu se știe dacă modurile alternative de replicare a ADN-ului dublu catenar (de exemplu, conservatoare sau dispersate) există în natură. Astfel, după fiecare eveniment de replicare, o catenă din ambele molecule fiice este părintele, conservată, iar cealaltă este fiica nou sintetizată. Acest mecanism de copiere este numit semi-conservator. Dacă genomul este reprezentat de ADN monocatenar (ca în unele viruși), atunci această singură catenă servește ca șablon pentru formarea unei catene complementare cu care formează un duplex și apoi fie duplexuri fiice, fie copii monocatenar ale pe acest duplex sunt sintetizate una dintre firele șablon.

Watson și Crick, aflati deja la a doua lor lucrare în 1953, au sugerat un posibil mecanism de copiere a materialului ereditar. Este ușor de imaginat că lanțurile unei molecule de ADN diverg și fiecare dintre ele devine un șablon pe care este sintetizat un nou lanț complementar. Ca rezultat, se formează două molecule fiice de ADN dublu catenar, care nu se pot distinge de molecula părinte.

În 1957, A. Kornberg a descoperit în bacterii E coli o enzimă care catalizează procesul de polimerizare a ADN-ului din nucleotide - ADN polimeraza 1. În 1959, Arthur Kornberg (A. Kornberg) a primit Premiul Nobel pentru descoperirea mecanismului biosintezei ADN-ului. El a arătat că dublarea moleculelor de ADN se bazează pe reacții biochimice obișnuite.

În general, reacția de adăugare a unei grupări 5"-deoxinucleotide la gruparea 3"-OH a nucleotidei terminale a lanțului de primer poate fi reprezentată după cum urmează:

N+dNTP<->n+1 + РР i

unde dNMP este oricare dintre cele patru nucleotide comune. În timpul unui act de replicare, catena care conține capătul 3’ este extinsă cu un rest nucleotidic, în timp ce pirofosfatul este îndepărtat simultan. Reacția de adăugare a nucleotidelor este reversibilă, dar deoarece fosfatul anorganic din celule este distrus rapid, reacția este direcționată activ spre sinteza. Replicarea ADN-ului are loc întotdeauna de la capătul 5’ al catenei de ADN (adică, care conține grupa 5’-deoxinucleotidă) până la capătul 3’ (adică, care conține gruparea 3-OH liberă) și necesită prezența unei sintetizate anterior. fragment al catenei de ADN ca primer pentru polimerizarea reacției. Un astfel de fragment de ADN cu un capăt liber 3’ se numește primer. Enzimele care catalizează reacția de adiție dependentă de primer, determinată de șablon de ADN a deoxinucleotidelor se numesc ADN polimeraze. Până în prezent, au fost izolate și caracterizate mai multe clase diferite de ADN polimeraze, iar proprietățile acestor enzime și reacțiile pe care le catalizează sunt descrise în detaliu. Vom vorbi în detaliu despre structura lor și caracteristicile individuale în capitolele următoare.

1.1. Furcă de replicare

Procesul de replicare are loc în structuri speciale numite furci de replicare. Structura schematică a furcii de replicare a E. coli este prezentată în Fig. 1. Faptul că cele două catene ale moleculei de ADN sunt situate antiparalel una față de alta creează o serie de probleme pentru replicarea lor multidirecțională simultană.

Pe măsură ce furca se mișcă, două lanțuri fiice trebuie sintetizate simultan. Furca se mișcă în direcția de la 5 " la 3' pe un lanț și de la 3 ’ la 5" - pe de alta. Totusi, acizii nucleici se sintetizeaza doar de la capatul 5" - pana la 3". Problema este rezolvata in asa fel incat pe unul dintre firele parinte se sintetizeaza continuu un fir nou in directia 5" - 3", care coincide cu mișcarea replicării furcii. Aceasta se numește șuviță de conducere sau de conducere. Cealaltă șuviță se numește șuviță de întârziere sau de întârziere, deoarece sinteza pe aceasta are loc cu o oarecare întârziere în comparație cu firul de conducere. Acest lucru se datorează faptului că ADN-ul de pe această catenă este, de asemenea, sintetizat de la 5" la 3", dar în direcția opusă mișcării furcii și în fragmente scurte. Datorită acestui fapt, sinteza ADN-ului multidirecțională poate fi realizată în o singură structură - furca de replicare.

Orez. 1. Diagrama unei furci de replicare.

Lungimea unor astfel de fragmente scurte la procariote este de 1000-2000 bp. După numele omului de știință care le-a descoperit, acestea au fost numite „fragmente Okazaki”. Pe măsură ce furculița de replicare progresează, capetele fragmentelor adiacente Okazaki se unesc pentru a forma un fir continuu. Pentru ca procesul de pe ambele catene să se desfășoare sincron, complexele de polimerază ale catenei conducătoare și întârziate sunt interconectate, formând o structură tridimensională complexă (Fig. 1, b)

Furca de replicare se poate deplasa fie într-o direcție de la originea de replicare, fie în ambele direcții. În funcție de aceasta, procesul se numește replicare unidirecțională sau bidirecțională. Cum arată aceasta schematic este prezentat în Fig. 2. La eucariote, replicarea este de obicei bidirecțională. De asemenea E coli.

Mecanismele de inițiere a replicării la originea replicării și formarea fragmentelor de Okazaki în firul rămas sunt similare în principiu, deși există unele diferențe subtile. În ambele cazuri, se formează primeri ARN scurti ( grunduri ), complementar ADN-ului șablon, sub forma unei continuare a căreia este sintetizată o nouă catenă de ADN. Ulterior, inserțiile scurte de ARN sunt înlocuite cu segmente de ADN, iar fragmentele individuale Okazaki sunt apoi combinate pentru a forma o catenă continuă.

Toate organismele vii de pe Pământ sunt de obicei împărțite în procariote și eucariote (din grecescul karyon - nucleu). Principala caracteristică a procariotelor este că, spre deosebire de eucariote, le lipsește un nucleu celular complet acoperit cu o membrană. Materialul genetic al procariotelor este situat în nucleoid, echivalentul primitiv al nucleului eucariotic. Celulele procariote au dimensiuni foarte mici - aproximativ 1 micron. Volumul celulelor eucariote este de 800-1000 de ori mai mare decât volumul celulelor procariote. Procariotele includ bacterii și arheea (sau arheobacterii), ai căror strămoși au apărut cu aproximativ 4 miliarde de ani în urmă. Eucariotele pot fi fie unicelulare, fie multicelulare. Au apărut pe Pământ la aproximativ 500 de milioane de ani după procariote.

Conform conceptelor moderne, metabolismul ADN-ului la procariote are unele diferențe față de cel la eucariote. Descriind procesele de replicare și recombinare, vom sublinia aceste diferențe de fiecare dată.

Capitolul 2. Începutul replicării

Replicarea ADN-ului nu începe în niciun punct aleatoriu al moleculei, ci în locuri specifice numite origini de replicare sau origini de replicare. Procesul de copiere continuă prin formarea de furci de replicare în una sau ambele direcții până când ADN-ul este complet duplicat. În moleculele de ADN circulare închise, catenele nou sintetizate sunt unite covalent la punctele de întâlnire ale furcilor de replicare crescânde sau în punctul în care o singură furcă se întoarce la originea replicării. Moleculele fiice, de regulă, diverg chiar înainte de începerea unei noi runde de replicare.

Genomi la fel de variați ca mărime precum genomul virusului SV40 (5,2 kb), un bacteriofag? (48,5 kb) și E. coli (4-10 3 kb), se reproduc ca rezultat al unui eveniment inițial care are loc la un anumit punct.

Orez. 2. Posibila deplasare a furcii de replicare.

În pro- și eucariote se pot găsi diverse variații pe această temă. Astfel, fiecare dintre catenele helixului părinte al ADN-ului mitocondrial animal (15 kb) are propria sa origine de replicare. Sinteza catenei complementare a unor genomi mici de fagi monocatenar începe aproape de o secvență specifică, iar replicarea duplexului rezultat poate iniția într-un punct complet diferit. Replicarea ADN-ului liniar dublu catenar inițiază, de asemenea, la locuri specifice. De exemplu, ADN-ul bacteriofagului T7 (40 kb) este replicat în două direcții opuse la capete diferite ale moleculei, pornind de la un punct și fiecare dintre cele două lanțuri de ADN ale adenovirusului uman (30-38 kb) este replicat secvenţial întotdeauna. de la capătul de 3".

Genomul celulelor eucariote se caracterizează prin prezența unor origini multiple de replicare împrăștiate de-a lungul cromozomului la o distanță de aproximativ 20 kb. După inițiere, replicarea continuă în două direcții din fiecare punct până când furcile de replicare a două origini de replicare adiacente se îmbină. ADN-ul de lungime completă al fiecărui cromozom fiică este obținut prin unirea catenelor mai scurte, inițiate independent, nou sintetizate.

2.1. Conceptul de replicon și originea replicării

Secțiunea de ADN în care este sintetizat un fragment separat al catenei conducătoare se numește replicon. Multe procariote au o singură origine de replicare în genomul lor, ceea ce înseamnă că au un singur replicon în ADN-ul lor. Genomii eucarioți sunt polirepliconi.

Originea repliconului unde este inițiată replicarea se numește originea replicării. Este originea care este recunoscută de complexele proteice speciale și pe ea începe formarea unei furci de replicare.

În unele cazuri, originea replicării are o astfel de secvență de nucleotide încât duplexul capătă o configurație neobișnuită care este recunoscută de proteinele implicate în inițiere. Natura interacțiunii dintre originea replicării și proteine și mecanismul de inițiere în general nu au fost suficient studiate, dar se poate spune că par a fi diferite în cazuri diferite.

2.2. Originea replicării E.coIi oriC

Originile E. coli și Bacillus subtilis au fost studiate în cele mai multe detalii. Regiunea de origine a replicării cromozomilor, oriC, include zone cu secvențe specifice, așa-numitele cutii ADN și secvențe scurte situate între ele. Cutiile de ADN cu un „motiv” specific de nucleotide, în principal 9 bp, sunt intercalate cu fragmente de 12-1 bp cu un conținut ridicat de AT. Secvențele cu nouă membri în sine pot fi localizate fie într-o poziție directă, fie inversată una față de alta. De exemplu, B. subtilis are un fragment TTATCACA și alte două cutii cu nouă membri orientate în direcția opusă, cu una dintre perechile de nucleotide înlocuită. În total, B. subtilis are 15 cutii ADN pe oriC. Regiunea oriC este foarte conservatoare: cutii ADN de compoziție similară sunt prezente în locul corespunzător de pe cromozom la alte bacterii (numai în Mycoplasma genitalium, în ciuda prezenței enzimelor de replicare comune tuturor bacteriilor, nu au fost găsite cutii ADN). Cutiile ADN în sine nu codifică proteine sau ARN, deși genele individuale sunt situate între ele. Produsele acestor gene sunt, de asemenea, în mare măsură implicate în „menținerea” procesului de replicare a ADN-ului.

Ordinea de aranjare a cutiilor ADN, regiunile intermediare și numărul lor sugerează că divergența evolutivă a oriC s-a datorat în principal dublărilor și triplicațiilor. O diagramă a „originei minime” abstracte a procariotelor este prezentată în Fig. 3.

Orez. 3. Organizarea originii minime a procariotelor

Schema originii minime a procariotelor.

2.3. Originile altor organisme

Partea centrală a originii replicării în virusul SV40 constă dintr-un element de identificare (ORE - element de recunoaștere a originii), necesar pentru legarea unui antigen T proteic special (T-ag), un element pentru legarea proteinei care desfășoară ADN-ul ( DUE - element de desfășurare a ADN-ului) și un element, îmbogățit cu nucleotide AT. Zona din care furculița de replicare începe să se miște în direcții opuse se numește originea replicării bidirecționale (OBR - origine bidirectional replication).

Elementele accesorii (Aux) leagă dimerii antigenului T (Aux-1) și factorul de transcripție Sp1 (Aux-2). Distanța dintre aceste elemente și orientarea lor joacă un rol important în procesul de inițiere a replicării. O diagramă a originii virusului SV40 este prezentată în Fig. 4.

La eucariote, omologii originilor de replicare sunt secvențe de replicare autonomă, sau ARS (secvențe de replicare autonomă), descoperite în 1980 de R. Davis și J. Carbone.

Orez. 4. Schema originii virusului SV40.

La drojdia Saccharomyces cerevisiae, secvențe speciale capabile să asigure replicarea fragmentelor de ADN în celula de drojdie au fost izolate mai devreme decât la alte eucariote. Mai târziu, astfel de secvențe au fost găsite în multe alte organisme. La S.cerevisiae, ARS ocupă 100-200 bp și conține o secvență consens specifică (ACS - secvența consens ARS), de 11 bp, necesară pentru legarea la proteina inițiatoare, precum și elemente suplimentare (elemente B) care sporesc funcția de origine. De exemplu, ARS1, prima origine care va fi caracterizată în detaliu, conține trei astfel de elemente: B1, B2, B3. Secvențele ACS și B1 ocupă aproximativ 50 pb și reprezintă cea mai mică regiune funcțională de orice origine care este necesară pentru legarea la proteina inițiatoare.

Elementul B2 conține de obicei o regiune DUE caracterizată genetic. Elementul accesoriu V3 leagă factorul de transcripție Abf-1. Lungimea totală a elementului ARS este de 100-200 bp. Structura originii S.cerevisiae este prezentată în Fig. 5.

Orez. 5. Schema originii Saccharomyces cereiseae

La o altă specie de drojdie, Shizosaccharomyces pombe, originile constau în cel puțin un ARS, care este semnificativ mai lung decât în S. cerevisiae. În unele cazuri, mai multe elemente ARS formează o zonă de inițiere a replicării. (Fig. 6.)

Orez. 6. Schema originii Shizosaccharomyces pombe

La mamifere, originile nu au fost caracterizate în detaliu; unele dintre ele sunt situate în spații intergenice, au site-uri de legare pentru factorii de transcripție și adesea conțin doar regiuni de inițiere a replicării bidirecționale (OBR).

2.4. Viteza de replicare

Rata de replicare a genomului este guvernată în primul rând de frecvența evenimentelor de inițiere. Astfel, la E. coli, viteza de copiere în fiecare furcă de replicare este constantă și egală cu aproximativ 1500 bp pe secundă: prin urmare, genomul complet cu o lungime de 4 × 10 6 bp este replicat în aproximativ 40 de minute. Dacă un cromozom se replic mai repede, aceasta înseamnă că frecvența evenimentelor de inițiere la aceeași origine a replicării crește la aceeași viteză de copiere. Celulele E. coli se divid la fiecare 20 de minute; aceasta înseamnă că replicarea ADN-ului este inițiată în cromozomi care nu au finalizat încă runda anterioară de replicare. Viteza de mișcare a furcii de replicare în celulele eucariote este mult mai mică (10-100 bp pe secundă), dar finalizarea replicării cromozomilor într-un timp rezonabil este asigurată de inițierea simultană în mai multe puncte. Deci, rata de replicare a cromozomilor este controlată de numărul și locația originilor replicării. De exemplu, la embrionii timpurii de Drosophila, replicarea unui singur cromozom are loc la fiecare 3 minute, datorită inițierii aproape simultane a evenimentelor în puncte distanțate la 7000-8000 bp. În același timp, se știe că la Drosophila în timpul dezvoltării embrionare timpurii, atât rata de replicare, cât și dimensiunea și numărul de repliconi sunt specifice țesutului. În cultura de celule somatice ale aceleiași Drosophila, rata de dublare a cromozomilor este mult mai lentă, deoarece replicarea începe la un număr mult mai mic de puncte situate la o distanță de 40.000 bp unele de altele, în timp ce durata fazei S este 600 de minute. Prin urmare, având în vedere o rată fixă de sinteză a ADN-ului, inițierea multiplă crește viteza procesului de replicare în ansamblu și reduce astfel timpul necesar pentru duplicarea întregului set de cromozomi. Datele despre numărul de repliconi și viteza de replicare sunt date în Tabelul 1.

Diferențe în ceea ce privește durata fazei S au fost găsite și la alte organisme. De exemplu, la triton faza S durează 1 oră în nucleii blastulei și 200 de ore în faza S premeiotică a spermatocitelor. Este probabil ca durata fazei S să fie determinată nu de rata de sinteză a ADN-ului, ci de numărul de origini de replicare implicate. În ADN-ul celulelor neurula de triton ele sunt situate la o distanță de aproximativ 40 µm unul de celălalt, iar în celulele somatice - aproximativ 100 µm.

tabelul 1

Numărul și lungimea repliconilor în diferite organisme.

În conformitate cu conceptele moderne, repliconii la eucariote nu sunt distribuiți aleatoriu în genom; ele sunt localizate în grupuri (focare de replicon). În aceste grupuri, sau focare, se adună enzimele de replicare, care extind furcile de replicare simultan la 10-100 de repliconi învecinați, fiecare având o lungime de aproximativ 100 kb. Replicarea în ele este finalizată în 45-60 de minute. În plus, există repliconuri foarte lungi (mai mult de 1000 kb) - atât de mari încât replicarea în ele continuă timp de câteva ore.

Activarea originilor de replicare are loc pe tot parcursul fazei S. De exemplu, S.cerevisiae ARS1 este activat în faza S timpurie, iar ARS501 este activat în faza S târzie. Majoritatea originilor sunt activate la mijlocul fazei S. Este interesant de observat că regiunile cromozomilor S.cerevisiae care se replic în faza S timpurie sau târzie sunt mozaic, adică mixte. La S.cerevisiae, s-a constatat că regiunea centrală a cromozomului IV se replic la început și telomerii în faza S târzie. O regiune ADN de 67 kb adiacentă telomerului de la capătul drept al cromozomului V și care conține ARS501 se replică în faza S târzie. Aparent, replicarea târzie a acestei regiuni cromozomiale este o consecință a apropierii sale de telomer. În plus, se știe că la sfârșitul fazei S, genele „tăcute” sunt replicate, de exemplu, locii HML și HMR, care nu sunt exprimați în anumite tipuri de celule și sunt localizate în regiuni subtelomerice. În contrast, genele exprimate activ, cum ar fi locusul MAT, sunt replicate în prima jumătate a fazei S.

Capitolul 3. Inițierea replicării

Originile replicării sunt locul din care furca de replicare își începe mișcarea. Dar ADN-polimerazele nu pot începe procesul de replicare fără ajutorul altor proteine. Proteinele implicate în recunoașterea originii și atragerea primazei către aceasta - ARN polimeraza, care sintetizează primerul, „semănătorul” pentru sinteza ADN - și ADN polimeraza, formează complexul de inițiere a replicării.

3.1 Inițierea replicării în E. coli

Inițierea replicării în oriC într-un sistem in vitro începe cu formarea unui complex care include șase proteine: DnaA, DnaB, DnaC, HU, Girase și SSB. Mai întâi, monomerul ADN se leagă de secvența cu nouă membri, apoi 20-40 de monomeri ai acestei proteine formează un agregat mare. ADN-ul de origine îl înconjoară, iar catenele de ADN sunt separate în regiunea a trei secvențe de treisprezece-mer. În următoarea etapă, dimerul DnaB/DnaC se alătură complexului oriC/DnaA, formând un agregat de aproximativ 480 kDa în dimensiune, corespunzător unei sfere cu o rază de 6 nm. Ca rezultat, se formează o furcă de replicare.

3.2. Inițierea replicării la eucariote

Inițierea replicării ADN-ului eucariotic începe cu formarea unui complex de origine de replicare și a unei proteine inițiatoare de replicare. Acest complex se numește post-replicativ (rost.-RC). Acesta servește ca o platformă pentru asamblarea structurilor de ordin superior care aduc cromatina într-o stare competentă pentru replicare. Etapele succesive ale formării complexelor de inițiere a replicării sunt prezentate în Fig. 7.

Proteina inițiatoare a replicării ADN-ului în celulele eucariote este ORC (complex de recunoaștere a originii), care a fost descris pentru prima dată în S.cerevisiae. Ulterior, proteinele asemănătoare ORC au fost descoperite și studiate la alți reprezentanți ai eucariotelor, precum și la mamifere și oameni. La toate eucariotele, ORC este format din șase subunități - Ogc1-Ogb (120-50 kDa). Toate cele șase subunități ale complexului sunt esențiale pentru activitatea de viață a S. cerevisiae. Două grupuri diferite de subunități ORC sunt implicate în recunoașterea secvențelor de origine atunci când se leagă de originea replicării. Orc1, Orc2 și Orc4 interacționează cu ACS, celelalte trei subunități recunosc elemente asemănătoare B1. Este posibil ca numai Orc5 să comunice cu secvențele de nucleotide ale B1. ORC se leagă în mod specific de ADN numai în prezența ATP și are activitate ATPază, care este reglată de interacțiunea coordonată a proteinei cu elementele ATP și ARS. ATP se leagă de subunitatea Orc1 și joacă rolul unui cofactor necesar pentru atașarea ORC la origine. Secvența specifică a originii care se leagă de ORC inhibă activitatea ATPazei a Orc1, în timp ce regiunile ADN monocatenar care apar în faza S o activează din nou. În acest caz, conformația ORC se schimbă – de la alungită (extinsă) la îndoită (îndoită). Este posibil ca legarea și hidroliza ATP de către subunitatea Orc1 să fie implicată în controlul funcțiilor ORC în ciclul celular.

În drojdia de fisiune S.pombe, proteina Orc4 conține în domeniul N-terminal așa-numitele „AT-hooks”, cu ajutorul cărora ORC se leagă de mai multe regiuni ale ARS1 bogate în secvențe AT. La S.cerevisiae, SRO se atașează la origine la sfârșitul mitozei, formând un complex post-replicativ (post-RC) și rămâne asociat cu acesta în ciclurile celulare ulterioare. În acest caz, post-RC există în fazele S, G2 și M, iar în faza G1 face parte din complexul pre-replicativ (pre-RC).

Complexul prereplicativ se formează pe baza post-RC; acest proces începe în toate originile simultan la limita fazelor M și G1 și se termină la sfârșitul lui G1 în originile care sunt activate mai întâi în timpul tranziției la faza S. . În originile care sunt activate mai târziu în faza S, formarea pro-RC este finalizată în perioada fazei S corespunzătoare fiecăreia dintre ele. În faza G1, în timpul asamblarii pro-RC, ORC este capabil să interacționeze cu kinaze dependente de ciclină (Cdks, kinaze dependente de ciclină). Această interacțiune este unul dintre mecanismele care permite celulei să formeze pro-RC după mitoză. Primele care se alătură post-RC la limita fazei M/G1 sunt proteina Cdc6 (proteina ciclului diviziunii celulare) și o familie de șase proteine Mst 2-7 (proteine de întreținere a minicromozomilor). Proteinele Mst 2–7 sunt cele mai cunoscute din familia proteinelor „mini-cromozomiale de întreținere” identificate pentru prima dată în S.cerevisiae la studierea mutanților incapabili să mențină stabilitatea mini-cromozomilor.

Orez. 7. Schema de inițiere a replicării la eucariote

Proteinele Cdc6 și Mst 2–7 au fost descrise la mulți reprezentanți ai eucariotelor, inclusiv a mamiferelor. Recent s-a demonstrat că în celule S. gura La eucariotele superioare, o altă proteină, Cdt1 (terminarea diviziunii celulare), participă la stadiul incipient al formării rge-RC. Proteinele Mst 2-7 formează complexul hexameric MSM, o componentă cheie a pro-RC. MSM generează un semnal de control asupra cromatinei nereplicate pentru a inhiba mitoza prematură în faza G1. De asemenea, este necesar ca celula să avanseze prin ciclu în faza S. Atașarea MSM la originea replicării este reglementată de fosforilarea-defosforilarea subunităților individuale ale acestui complex. De exemplu, defosforilarea parțială a subunității Mct4, hiperfosforilată în faza M, promovează formarea de pro-RC, iar defosforilarea completă a subunității Mct3 inactivează complexul și previne legarea acestuia de cromatină. În același timp, atașarea MSM la origine depinde de proteinele Cdc6 și Cdt1, care împreună „impun” MSM pe cromatină. În absenţa celulelor Cdc6 S.cerevisiaeîși pierd capacitatea de a iniția replicarea ADN-ului și suferă mitoză „trunchiată”, iar cromozomii nereplicați se segregează aleatoriu la polii fusului.

Capacitatea Cdc6 de a preveni mitoza trunchiată până când replicarea ADN-ului este completă este asigurată de interacțiunea sa cu Cdks. Activitatea lui Cdc6 în faza G1 este, de asemenea, reglementată de interacțiunea sa cu ATP, deoarece mutațiile în secvențele conservate ale motivului de legare a ATP al Cdc6 au dus la pierderea capacității cromatinei de a atașa MSM în celule. S.cerevisiaeși la suprimarea replicării ADN-ului în celulele umane. U S.cerevisiae O altă proteină, Mcm10, care este asociată cu cromatina și interacționează cu componentele Mcm2-7, participă la atașarea MSM la rge-RC. Un astfel de control complex al legării MSM la origine indică faptul că există un sistem în mai multe etape de mecanisme de reglare în celulă necesar pentru a preveni mitoza repetată cu cromatina nereplicată. Legarea MSM de originile replicării este necesară pentru a asigura stabilitatea genomului; aceasta este cea care transferă cromatina într-o stare numită „replicare-licențiere”. La ceenopus, legarea MCM necesită prezența unui factor suplimentar care poartă același nume, RLF-B (factor B de autorizare a gerlicației). Proteinele MCM prezintă afinitate pentru histone mai degrabă decât pentru ADN, cu rezultatul că, la sfârșitul fazei G1, întregul complex prereplicativ este atașat ferm de cromatină direct la sau aproape de originea replicării.

În faza G1, kinaza Cdc7 cu subunitatea sa reglatoare Dbf4 (factor de legare la ADN 4) se alătură pro-RC parțial format, iar în faza G1 târzie sau la limita fazelor G1/S, proteina Cdc45 și un singur proteina A de replicare care leagă ADN-ul catenar (RPA) join, proteina de replicare A). Interacțiunea dintre Cdc45 și Dbf4/Cdc7 în faza G1 târziu este necesară pentru „pornirea” ulterioară a replicării în origini după asamblarea pro-RC.

Kinaza Dbf4/Cdc7 se leagă de ori cu ceva timp înainte de a începe să-și îndeplinească funcțiile. Fiind atașată la pro-RC, kinaza Dbf4/Cdc7 „așteaptă” ca Cdk să fie activat și numai după aceea își fosforilează substraturile. Rolul legării „timpurii” a acestei kinaze la ori rămâne neclar.

Legarea Cdc45 la cromatină depinde de proteinele Cdc6 și Mct2 și de activitatea kinazei Dbf4/Cdc7 și a kinazelor de fază S dependente de ciclină (faza Cdk-S - Cdc28/Ckb5.6 în drojdie și Cdk2/Cuclins A , E la eucariotele superioare). Proteina Cdc45 poate fi fosforilată de kinaza Dbf4/Cdc7, dar acest lucru are loc numai după activarea fazei Cdk-S. Activitatea Cdk-S este la rândul său reglată de inhibitorul Sic1, care suferă proteoliză dependentă de ubiquitină la sfârșitul fazei G1. Atașarea proteinei Cdc45 la pro-RC are loc în faza G1 târzie a ciclului celular doar la originile acelor repliconi care încep sinteza ADN mai întâi în timpul tranziției la faza S. Legarea dependentă de Cdk-S și Dbf4/Cdc7 a Cdc45 la alte origini are loc la un moment specific pentru fiecare dintre ele pe parcursul întregii faze S. Mecanismul probabil de atașare a Cdc45 la rge-RC este următorul: Dbf4/Cdc7, care s-a legat de toate originile de replicare în faza G1, după expunerea la Cdk-S, fosforilează Mct2 în fiecare origine în perioada respectivă a faza S, care este determinată individual pentru fiecare origine. Ca urmare a fosforilării lui Mct2, conformația complexului MCM se modifică în așa fel încât dobândește capacitatea de a lega Cdc45. În același timp, proteina RPA se atașează de pro-RC. La fel ca Cdc45, RPA se leagă de origine într-o manieră dependentă de Cdk-S, cu participarea Mct2. Atașarea proteinelor Cdc45 și RPA completează asamblarea pro-RC. Imediat după finalizarea ansamblării pro-RC, are loc disocierea parțială a acestuia, însoțită de începutul formării RC (complex de replicare). Proteina Cdc6 este prima care se disociază de pro-RC în timpul tranziției de la faza G1 la faza S sau chiar mai devreme, fiind supusă fosforilării de către Cdks, urmată de ubiquitinare și degradare. Această cale de inactivare a Cdc6 a fost demonstrată atât pentru eucariotele inferioare, cât și pentru unii reprezentanți ai eucariotelor superioare. În celulele umane, nivelul de Cdc6 rămâne constant pe tot parcursul ciclului celular. Dar în timpul tranziției la faza S, Cdc6 este transportat de la nucleu la citoplasmă. Aparent, acest proces este reglementat și de Сdks. Îndepărtarea Cdc6p din nucleu (prin hidroliză sau transport în citoplasmă) este unul dintre mecanismele care previne evenimentele multiple de replicare în timpul unui singur ciclu celular.

Proteina Cdt1 este de asemenea inactivată după terminarea formării rge-RC. Mai mult, în celulele eucariotelor inferioare Cdt1. se exprimă periodic, acumulându-se în nuclee în faza G1, iar în faza G2 nivelul său scade. La eucariotele superioare, activitatea Cdt1 este controlată de proteina inhibitoare geminină, care este absentă în celule în faza G1, se acumulează în timpul fazelor S, G2 și parțial în timpul fazei M și dispare în faza M la limita metafazei și anafaza.

Spre deosebire de Cdc6 și Cdt1, proteinele Mct2-7, RPA și Cdc45, disociate de pro-RC, rămân asociate cu cromatina în faza S în timpul sintezei ADN. Eliberarea rapidă a MCM din pte-RC în celulele de drojdie este asigurată de interacțiunea dintre Mcm10 și Mct7. Separarea MSM și Mst10 este facilitată de proteina Cdc45.

Subunitățile Mst4,6,7 ale complexului MSM au activitate helicazică, care se manifestă numai atunci când este stimulată de kinaza Cdk-S și Dbf4/Cdc7. Proteinele Mst2-7 sunt esențiale nu numai pentru inițiere, ci și pentru faza de alungire a replicării și progresia furcilor de replicare. MSM face parte din RC și participă la derularea ADN-ului dublu catenar în furcile de replicare. În celulele umane, legarea MCM la origine în timpul formării RC se realizează cu participarea proteinei Mcm10, care se acumulează și formează un complex cu cromatina în faza S, spre deosebire de Mcm10. S. cerevisiae. În timpul tranziției celulelor de la faza G2 la faza M, Mcm10 hiperfosforilează și disociază de cromatină, iar la limita fazei M/G1 suferă proteoliză prin mecanismul proteazomal. Astfel, fosforilarea și proteoliza Mcm10 în celulele umane reglează negativ activitatea MCM după finalizarea replicării ADN-ului. În plus, reglarea negativă a activității MSM poate rezulta din fosforilarea directă a componentelor individuale ale complexului în sine. De exemplu, fosforilarea situsurilor specifice Cdk ale Mcm4 în faza M duce la pierderea activității helicazei a Mct4,6,7 și la o concentrație mare a complexului Cdk-ciclină E în nucleele embrionilor. Heporus previne legarea Mst3 de ADN și astfel împiedică reasociere Mst3 cu cromatina după terminarea replicării. Complexul MSM este implicat nu numai în etapele incipiente ale inițierii replicării în timpul tranziției celulelor în faza G1, ci și în finalizarea acestui proces în faza S. Mai mult, în etapa finală de inițiere a replicării, MSM efectuează două funcții: desfășoară ADN-ul la origine și servește ca o schelă de care restul sunt atașate componente în formarea RC. Prin urmare, mecanismele multiple care reglează activitatea MSM sunt de înțeles. Dacă în faza G1 aceste mecanisme au ca scop promovarea celulelor în faza S fără mitoză repetată, atunci în fazele S și G2 ele împiedică replicarea cromatinei deja replicate.

RPA este o proteină care leagă ADN-ul monocatenar, iar prezența sa în RC în timpul inițierii replicării este necesară pentru a stabiliza regiunea ADN-ului nerăsucită. RPA este format din trei subunități cu mase moleculare de 70, 34 și 11 kDa, subunitatea de 70 kDa având activitate de legare la ADN monocatenar, iar subunitatea de 34 kDa fiind reglatoare. Acesta din urmă este fosforilat de Cdk, care este aparent necesar pentru activarea replicării ADN-ului. O descriere detaliată a acestui complex va fi dată mai jos.

Proteina Cdc45 este, de asemenea, implicată în formarea RC. Este necesar ca ADN polimeraza să se atașeze? la originile replicării. S-a demonstrat că proteina umană Cdc45 se leagă de proteina umană Mct7 și de subunitatea p70 a ADN polimerazei? in vitro. Se atașează Cdc45 de ADN polimerază? la RC prin legarea la Mst7. În celulele de drojdie S.cerevisiae Se atașează Cdc45 de ADN polimerază? la cromatină cu participarea Mst2.

Una dintre componentele complexului care inițiază replicarea ADN-ului este ADN polimeraza?. Dintre toate numeroasele ADN polimeraze ale eucariotelor, aceasta este cea care conține activitate primază, capabilă să sintetizeze un „amors” scurt de ARN - un primer din trifosfații ribonucleozidici. Primerul ARN generează un semnal, care este unul dintre declanșatorii replicării. ADN polimeraza? găsit la toate eucariotele studiate și este bine studiat. O descriere detaliată a acestei enzime va fi dată în secțiunea următoare. S-a demonstrat că una dintre căile de reglare a inițierii replicării este asociată cu fosforilarea a două subunități mari ale ADN polimerazei? sub influența CDK. În acest caz, ciclina E și Cdk stimulează inițierea replicării atunci când celula intră în faza S, iar ciclina A și Cdk o inhibă în faza G2.

Este evident că activarea originilor „active timpurii și târzii” menționate mai sus S.cerevisiae depinde de kinaza Dbf4/Сdс7р. Este probabil ca în fiecare origine să existe o reglare locală a activității sale de către proteine kinaze suplimentare, de exemplu Rad53. Rad53 kinaza blochează lansarea originilor „active târzii” în faza S timpurie. Când acest blocaj este îndepărtat, kinaza Dbf4/Cdc7p activează MSM, ceea ce duce la mai multe consecințe: stimularea activității helicazei MSM și legarea proteinei RPA și ADN polimerazei? cu origini de replicare. Atașarea ADN polimerazei? la RC, derularea ADN-ului la origine și sinteza primerului ARN completează procesul de inițiere a replicării ADN-ului eucariotic. Trebuie remarcat faptul că rolul ADN polimerazei? limitată doar la inițierea replicării ADN-ului. Această ADN polimerază nu este capabilă de sinteză procesivă, adică extinsă, de ADN și nu are activitate corectivă. Prin urmare, mai târziu în procesul de replicare, acesta adaugă aproximativ 20 de nucleotide la primerul ARN și este înlocuit cu ADN polimeraze? sau?.

Rost-RC, a cărui formare începe întregul lanț de evenimente în procesul de inițiere a replicării ADN-ului, suferă modificări în faza S a ciclului celular. Aceste modificări se referă la afinitatea ORC pentru ADN. De exemplu, proteina Orc1 Kheporis formează un complex puternic cu cromatina în interfaza timpurie până la finalizarea ansamblului pro-RC. Apoi, în faza S, afinitatea lui Orc1 pentru ADN scade. La mamifere, Oc1 se disociază de cromatină în faza S, se transformă într-o formă mono- sau diubiquitinată, apoi deubiquitinată și se leagă din nou de ADN în timpul tranziției de la faza M- la G-1. Proteina Oc2, dimpotrivă,

rămâne asociat cu cromatina pe tot parcursul ciclului celular și nu este un substrat pentru ubiquitinare. În celulele umane în faza S, un complex de proteine care conțin Orc1 și Orc2 se disociază de cromatină, care se reasociază la sfârșitul mitozei. În celulele de drojdie S. gura ORC suferă modificări post-translaționale în ciclul celular: în faza S începe fosforilarea uneia dintre subunitățile sale, Orc2, care atinge un maxim în fazele G2 și M. Astfel, în celulele eucariote, unul dintre mecanismele care împiedică re-replicarea cromatinei deja replicate este asociată cu inactivarea post-RC fie prin disocierea lui Oc1 de acesta (la eucariotele superioare), fie prin fosforilarea Oc2 (la eucariotele inferioare).

masa 2

Complexe de inițiere a transcripției la eucariote

Pentru a facilita înțelegerea secvenței de legare a diferitelor proteine la originea replicării, consultați Tabelul 2.

În ultimii câțiva ani, s-au înregistrat progrese semnificative în înțelegerea mecanismelor de reglare a aproape fiecarei etape de inițiere a replicării. Ele sunt efectuate la nivelul de funcționare a tuturor componentelor care formează complexe post-, pre- și replicative. Aceste componente sunt expuse nu doar unuia, ci mai multor factori diferiți. Un exemplu în acest sens este reglarea complexului MSM, a cărui activitate depinde direct de proteinele Cdc6, Mst10, Cdt1, kinaze dependente de ciclină, kinaza Dbf4/Cdc7 și fosfataze. Modelele de inițiere a replicării ADN-ului în embriogeneză și factorii care influențează aceste procese sunt încă puțin înțelese.

Capitolul 4. Mecanismul de formare și necesitatea unui primer ARN

4.1. Sinteza primerului pentru reacția polimerazei

ADN-polimerazele nu pot începe sinteza ADN-ului direct pe șablon, dar sunt capabile să adauge doar noi unități dezoxiribonucleotide la capătul de 3" al unui lanț polinucleotidic existent. Un astfel de lanț preformat la care se adaugă nucleotide se numește primer (sau primer) ; constă din ARN . Un primer scurt ARN este sintetizat din ribonucleozide trifosfați de către o enzimă numită ADN primază. Activitatea primazei poate aparține fie unei enzime separate, fie uneia dintre subunitățile ADN polimerazei. Primaza se leagă de helicază și ADN, formând o structura numita primozom si sintetizeaza primerul de ARN.Primii de ARN sunt extinsi prin actiunea ADN polimerazei III la prokarite si a ADN polimerazei III la eucariote.Acest proces pe catena intarziata este prezentat schematic in Fig. E coli Primerii sunt sintetizați de o enzimă specială separată - primaza.

Orez. 8. Primeri de ARN pe lanțul întârziat

4.2. Conceptul de duplex ARN-ADN

ADN-ul este de obicei prezent în celulă în forma B. În plus, sunt descrise încă două forme posibile ale stării ADN - A și Z. Aceste forme sunt prezentate în Fig. 9. Interacțiunea bazelor în forma B este prezentată în Fig. 10.

În forma A, planurile de bază formează un unghi de 20 de grade cu perpendiculara pe axa helixului (în forma B - 0), distanța dintre perechile de baze scade la 0,29 nm (în forma B - 0,34 nm). ), numărul de perechi pe tură crește la 11 –12 (pentru forma B – 10).

Perechile de baze din forma A sunt foarte puternic îndepărtate de axa helixului spre periferia moleculei - aproape jumătate din rază; deplasarea ajunge la 4–5 Å, iar în forma B a ADN-ului este aproape de zero.

Orez. 9. Forme posibile de ADN

Când se formează un primer (procesul de sinteză a acestuia va fi prezentat mai detaliat când se descrie ADN polimeraza? eucariote), se formează un duplex ADN-ARN, care există în forma A. Asa de

Astfel, forma A a duplexului asigură un echilibru optim între interacțiunile hidrofobe și complementare dintre bazele șablonului și primer.

Orez. 10. Aranjamentul reciproc al nucleotidelor în ADN în formă B

4.3. Enzime cheie implicate în sinteza ADN-ului

Multe detalii cunoscute acum despre procesul de replicare a ADN-ului au fost stabilite prin studii ale comportamentului și activității enzimelor care asigură funcționarea aparatului de replicare. Mecanismul de replicare a ADN-ului bacterian, în special ADN-ul, a fost studiat cel mai pe deplin E coliși bacteriofagi care se înmulțesc în ea. Enzimele de replicare a drojdiei sunt, de asemenea, destul de bine cunoscute. Drosophila, mamifere.

4.3.1. ADN polimeraze

Subsecvențele ADN sunt prezente în toate celulele procariote și eucariote. Mai mult, mulți virusuri bacteriene și animale induc formarea de ADN polimeraze sau proteine specifice virusului care facilitează participarea eficientă a ADN polimerazelor celulei gazdă la replicarea ADN-ului viral.

Multe ADN polimeraze procariote și eucariote au fost izolate în formă pură, iar proprietățile lor fizice și enzimatice au fost caracterizate în detaliu. Și deși aceste proprietăți nu sunt în întregime identice, mecanismul de cataliză pentru toate aceste enzime este în general același.

Orez. 11. Principiul general al structurii ADN polimerazelor.

Structura primară a ADN polimerazelor eucariote conține motive conservate care sunt omoloage cu motivele corespunzătoare ale enzimelor procariote. Acest lucru confirmă faptul că toate enzimele de sinteză a ADN-ului au un plan structural comun. Principiul general al structurii ADN polimerazelor este prezentat în Fig. 11. Din punct de vedere al formei, ADN polimerazele pot fi asemănate cu o mână dreaptă întredeschisă, în care palma, degetul mare și alte degete reprezintă trei domenii spațiale principale și formează o cavitate care deține șablonul și sămânța ADN în timpul sintezei. Motivele conservate A, B și C formează centrul activ în domeniul „palmă”, „degetele” țin șablonul monocatenar, iar „degetul mare” presează primerul - regiunea șablonului dublu catenar.

Acest model poate fi modificat pentru diferite tipuri de ADN polimeraze eucariote. ADN-polimerazele lucrează împreună cu diverse complexe proteice care le țin la bifurcația de replicare. Cel mai adesea sunt numite „clemă” și „încărcător cu clemă”.

După ce ADN-polimeraza se combină cu clema, „încărcătorul cu clemă” se îndepărtează de locul de reacție, dar rămâne aproape de lanțul întârziat pentru a se încărca la noul loc de fuziune primer-șablon odată ce ADN-polimeraza se disociază la finalizarea sintezei Okazaki anterioare. fragment. Acest proces este reprezentat schematic în Fig. 12. Acești complexe la eucariote și rolul lor în replicare vor fi discutate în detaliu mai jos.

4.3.1.1. ADN polimeraze procariote

Polimerazele procariote sunt desemnate cu cifre romane (spre deosebire de polimerazele eucariote, care sunt desemnate cu litere grecești). Cea mai complet studiată ADN polimeraza I (Po11) E coli. Este o singură polipeptidă cu activități multifuncționale. Ca o ADN polimerază, Po11 catalizează transferul de unități 5"-deoxinucleotidil ale deoxinucleozide-5"-trifosfați către grupa 3"-OH din catena ADN sau ARN, după care baza transferată se perechează cu baza corespunzătoare a ADN-ului complementar. Astfel, pentru polimerizare enzima necesită un primer ca acceptor al deoxinucleotidei și un șablon care determină atașarea nucleotidei dorite.Pe lângă polimerizarea nucleotidelor, Po11 catalizează alte două reacții, al căror rol biologic este foarte important.Într-una dintre ele are loc hidroliza legăturilor fosfodiester într-o catenă de ADN sau la capătul nepereche al ADN-ului duplex. Mai mult, o nucleotidă este îndepărtată pe act, începând de la capătul de 3" al lanțului. ( 3"-5" exonucleaza). A doua reacție implică, de asemenea, scindarea nucleotidelor, dar hidroliza începe de la capătul 5" al ADN-ului dublu catenar spre capătul 3" (exonucleaza 5"-3"). Aceste activități diferite sunt inerente în diferite situsuri ale lanțului polipeptidic Poli.Dacă PolI este tratat cu tripsină in vitro, lanțul polipeptidic se va împărți în fragmente mari și mici. Fragmentul C-terminal mare („fragment Klenow”) reține activitățile ADN-polimerazei și exonucleazei 3"-5"; fragmentul N-terminal mic are doar activitate exonuclează de 5"-3".

Polii și activitățile sale exonucleaze inerente joacă un rol foarte important în replicarea și repararea ADN-ului cromozomial E coli. Activitatea exonucleazei 3'-5" asigură controlul asupra adăugării fiecărei nucleotide și a eliminării nucleotidelor eronate din lanțul nou sintetizat. Dacă această activitate este suprimată ca urmare a unor mutații în gena care codifică Poli, atunci mutațiile apar adesea în timpul genomului. replicare - substituții de baze.

Capacitatea ADN polimerazei de a extinde capătul de 3" al unei catene asociate cu o catenă șablon îi permite să umple golurile dintre segmentele catenei întârziate. PolI extinde fragmentele Okazaki de la capetele de 3" și elimină ribonucleotidele primer din care se termină cele de 5" începe fragmentele adiacente, ceea ce este o condiție prealabilă necesară pentru formarea unei catene continue, deoarece PolI este capabil să extindă capătul de 3" al uneia dintre catenele la locul unei ruperi a ADN-ului dublu catenar și să elimine nucleotidele din Sfârșitul aceleiași pauze de 5" (un proces numit traducerea poreclei ), această enzimă joacă un rol cheie în repararea ADN-ului deteriorat. Translația Nick este utilizată pe scară largă in vitro pentru a sintetiza ADN radiomarcat.

U E coli Există alte două ADN polimeraze, dar acestea sunt prezente în celulă în cantități mai mici. PolII adaugă nucleotide mult mai puțin eficient decât Po11 și nu are activitate exonuclează de 5"-3". În consecință, RolII poate umple golurile dintre fragmentele de ADN împerecheate cu catena șablon, dar nu este capabil să scindeze nucleotidele ARN din fragmentele Okazaki sau să efectueze translația nick. Rolul RolII în replicarea și întreținerea ADN-ului cromozomial E coli este încă neclar. Este posibil ca acesta să fie implicat în restabilirea sintezei ADN-ului după deteriorarea și oprirea furcii de replicare. Acest proces se numește de obicei resinteză.

Holoenzima PolIII este enzima cheie responsabilă pentru replicarea ADN-ului cromozomial E coli. Fiecare celulă conține doar 10-20 de copii de PolIII, o holoenzimă, dar este componenta principală a complexului multienzimatic de polimerază care inițiază formarea de furcături de replicare la originile replicării, participă la alungirea catenei principale din furcă și se alungește. primeri ARN pentru a forma fragmente Okazaki. Deoarece PolIII, o holoenzimă, nu are activitate exonuclează de 5"-3", replicarea catenei întârziate necesită participarea lui Poll, astfel încât produsul format cu participarea PolIII este alungit și primerii ARN sunt îndepărtați la capătul de 5" de fragmente Okazaki.

Folosind metoda analizei mutațiilor țintite, au fost detectate modificări în lanțul polipeptidic al enzimei principale (de bază) PolIII și au fost studiate substituțiile de aminoacizi, care fac posibilă atribuirea anumitor tipuri de activitate enzimatică unor subunități specifice ale complexului enzimatic. Astfel, subunitatea a are activitate polimerază, iar subunitatea a are activitate 3"-5"-exonuclează. Cu toate acestea, complexul de subunități a și p are activități de polimerază și exonuclează semnificativ mai mari decât fiecare dintre subunitățile corespunzătoare în mod individual. Funcția celei de-a treia subunități α este încă neclară.

În plus față de subunitățile care alcătuiesc miezul PolIII, holoenzima PolIII conține încă șapte subunități: ?,?,?,?,?’,? și?. Polipeptidele enumerate există, de asemenea, în mai multe copii, astfel încât, ca urmare, spun ei. masa complexului polimerazei este de aproximativ 10 3 kDa. Rolul subunității β este de a minimiza probabilitatea ca enzima să se separe de matrice înainte de finalizarea procesului de copiere, adică funcționează ca o „clemă”. Subunitate? este un factor în dimerizarea holoenzimelor replicative. Funcția exactă a celorlalte subunități este necunoscută. Este posibil ca holoenzima PolIII să existe în două forme, fiecare dintre ele conţinând un set specific de subunităţi auxiliare care conferă anumite proprietăţi enzimei. Într-o formă, enzima catalizează sinteza unui lanț continuu conducător, iar în cealaltă, a unui lanț discontinuu.

Holoenzima PolIII catalizează aceleași reacții de sinteză ca și PolI, dar funcționează de aproximativ 60 de ori mai rapid. Mai mult, holoenzima PolIII are afinitate crescută pentru șablon și oferă o eficiență mai mare de copiere. Holoenzima PolIII se poate lega și de alte proteine, crescând eficiența procesului de copiere prin coordonarea mai multor etape enzimatice importante de replicare. La acest nivel superior de organizare, complexele pot include proteine care desfac helixul ADN la originile replicării și la bifurcile de replicare (helicaze), inițiază formarea ARN-urilor primer (primaze), asigură extensia secvenţială a lanţurilor de ADN, termină replicarea. procesează și separă elice ADN fiice.

ADN-polimerazele sintetizate de alte bacterii și mulți bacteriofagi diferă prin structura fizică și proprietățile lor. Cu toate acestea, reacțiile pe care le catalizează sunt aproape identice cu reacțiile studiate de E coli. Toate ADN-polimerazele au o exonuclează 3"-5" de corectare, dar majoritatea enzimelor nu au o exonuclează 5"-3". De exemplu, ADN-polimeraza fagului T4 poate efectua reacția exonucleazei 3"-5" și poate corecta erorile de replicare, dar nu este capabilă să catalizeze reacția exonucleazei 5"-3" și, prin urmare, nu poate asigura translația pornirii. În timpul replicării ADN-ului fagului T4, reacția exonuclează de 5"-3" de îndepărtare a primerilor ARN înainte de combinarea fragmentelor Okazaki este catalizată de o altă proteină codificată de fag. În procesul de sinteză intermitentă a catenelor întârziate și repararea daunelor ADN-ului în fagul T4, această enzimă funcționează în concordanță cu ADN polimeraza fagică. Unii virusuri animale (de exemplu, virusul herpes, virusul vaccinia și virusul hepatitei) induc sinteza polimerazelor speciale pentru a-și replica genomul.

Alți virusuri produc proteine care stimulează sistemele de replicare a ADN-ului celular sau participă la replicarea ADN-ului viral. De exemplu, papovavirusurile sintetizează proteinele necesare pentru a iniția replicarea. Adenovirusurile umane codifică proteine care „declanșează” inițierea sintezei ambelor catene de ADN viral liniar. De asemenea, produc proteine speciale care leagă ADN-ul care facilitează replicarea.

4.3.1.2. ADN polimeraze eucariote

Multe ADN polimeraze au fost identificate în celulele eucariote, dar proprietățile lor fizice și funcționale au fost studiate mai puțin detaliat decât cele ale enzimelor procariote corespunzătoare.

Tabelul 3

ADN polimeraze eucariote

Structura spațială exactă, determinată folosind analiza de difracție cu raze X, este cunoscută doar pentru o ADN polimerază eucariotă - polimerază de tip β, care diferă semnificativ ca structură de alte ADN polimeraze eucariote. Un rezumat al principalelor polimeraze eucariote este prezentat în Tabelul 3.

4.3.1.3. ADN polimeraza? – primasa

În celulele eucariote, sinteza ADN-ului are loc în principal în structuri dense specifice („fabrici replicative”) atașate de matricea nucleară difuză. Se presupune că fosfolipidele joacă un anumit rol în organizarea moleculară a matricei nucleare și că ADN-ul este asociat cu scheletul nuclear prin interacțiuni hidrofobe. „Fabricile de replicare” sau complexele de replicare 21S includ un grup de enzime constând din cel puțin 30 de proteine cu o greutate moleculară de 15 până la 300 kDa și conțin, în plus față de ADN polimerază? – primaza este, de asemenea, o exonuclează 3"-5", ADN ligaza I, RNază H, ADN topoizomeraza I, ADN helicaza, PCNA și o serie de alți factori. Acest complex conține, de asemenea, RPA, care interacționează în mod specific cu subunitatea p48 a complexului polimerază-primază. Aprovizionare semnificativă de ADN polimerază? se acumulează în ouăle echinodermelor, amfibienilor, peștilor teleostei și Drosophila pentru a asigura replicarea intensivă a ADN-ului nuclear în timpul dezvoltării timpurii.

De obicei, ADN polimeraze? nu au activitate de exonuclează de corectare 3"-5". Cu toate acestea, în subunitatea catalitică a ADN polimerazei de 182 kDa? La Drosophila, a fost descoperită o exonuclează 3"-5", care prezintă activitate numai la disociarea subunității de 73 kDa.

Forma multiproteica a ADN polimerazei? conţine, de asemenea, o proteină care leagă dinucleotidul diadenozin tetrafosfat (Ap 4 A). Se presupune că Ap4A este implicată în replicarea ADN-ului și diviziunea celulară. Există dovezi ale capacității ADN-polimerazei? utilizați Ap 4 A ca grund. Cu toate acestea, participarea Ap 4A ca primer in vivo este puțin probabilă; mai degrabă, este utilizat ca efector. Interesant este că triptofanil-ARNt sintetază, care sintetizează această dinucleotidă, este localizată în același complex multiproteic.

De obicei, complexul primază-polimerază? constă din patru subunități: o subunitate mare cu o greutate moleculară de 180 kDa sau o familie de polipeptide cu dimensiuni de la 140 la 160 kDa; subunități cu o masă moleculară de aproximativ 68–70 kDa și două subunități mici cu mase moleculare de 54–58 și 46–50 kDa. Subunitatea p180 este responsabilă pentru funcția polimerazei. Activitatea primazei este asociată cu două subunități mici. În acest caz, subunitatea de 48 kDa este catalitică și realizează direct amorsarea ADN-ului, iar subunitatea de 58 kDa este implicată în legarea nucleotidei purinice inițiale și atașarea subunității p48 la ADN polimeraza. De asemenea, afectează viteza de polimerizare și stabilitatea produsului sintetizat de subunitatea de 48 kDa. p58 facilitează, de asemenea, intrarea lui p48 din citoplasmă în nucleu. Subunitatea p180 interacționează direct cu p58.

Asociată cu subunitatea catalitică este o subunitate de 68-70 kDa, care este necesară pentru transportul polipeptidei catalitice în nucleul celulei. Este subunitatea de 68-70 kDa implicată și în reglarea nivelurilor ADN polimerazei? în celulă, stimulează sinteza unei polipeptide catalitice. Deși complexul ADN polimerază p-primază constă din patru subunități, compoziția cantitativă a acestui complex poate varia. Posibil polimeraza? și primaza se găsesc în „cortex” într-un raport de 1:3.

4.3.1.4. Răspuns de amorsare

Inițierea replicării și sintezei intermitente a ADN-ului pe lanțul întârziat are loc prin mecanismul primerului ARN și este o proprietate universală a replicării ADN-ului la pro- și eucariote.

Primaza ADN diferă de alte ARN polimeraze printr-un număr de proprietăți unice. În primul rând, specificitatea matricei și substratului. În al doilea rând, prin procesivitate neobișnuită - sinteza multimerilor care sunt multipli de unități de 10 nucleotide. În al treilea rând, precizia scăzută și rezistența la unii inhibitori ai ARN și ADN polimerazelor. Aici este necesar să revenim la problema sintezei primerilor ARN. Sinteza primerilor de ARN pe matrițe naturale începe în mai multe, dar nu aleatoriu, situsuri; inițierea sa are loc cu ATP sau GTP chiar și la concentrații mari de CTP și UTP. S-a demonstrat că, de exemplu, ADN-ul virusului SV40 conţine situsuri de iniţiere preferate - 3"-dCTTT sau 3"-dCCC, situate în regiuni de 7-25 nucleotide pirimidinice. Un raport mare ATP/GTP crește probabilitatea de inițiere în regiunile 3"-dCTTT, în timp ce un raport scăzut crește probabilitatea de inițiere în regiunile 3"-dCCC. Astfel, concentrația de NTP și secvența de nucleotide a matriței determină situsurile de inițiere. Cu toate acestea, situsurile de inițiere in vivo diferă semnificativ de situsurile de inițiere utilizate în timpul replicării ADN-ului SV40. În multe cazuri, a fost găsită secvența 5"-YYYYYYYCTTTYYYY-3", unde Y = C sau T, care este punctul de plecare pentru inițierea sintezei ADN de către primază ca parte a unui complex cu ADN polimeraza?. Lungimea minimă a clusterului de pirimidină trebuie să fie de cel puțin 7 nt. Înlocuirea uneia dintre pirimidine la capătul de 3" al clusterului reduce semnificativ frecvența de inițiere, iar substituțiile din interiorul și din exteriorul clusterului conduc la o schimbare a punctului de plecare. Se știe că șablonul este recunoscut de primaza ADN-ului însăși. Nucleotida de pornire a unui primer nou sintetizat este întotdeauna o purină (cel mai adesea adenină).

Acest complex are o altă funcție specifică: sinteza catenei telomerică întârziată a ADN-ului de mamifer este realizată de ADN polimerază a-primaza.

ADN primaza este o enzimă relativ lentă. Rata medie de încorporare a NTP de către această enzimă este cu aproximativ două ordine de mărime mai mică decât rata de încorporare a dNTP de către ADN polimeraza. ADN polimeraza? capabil să extindă primerii mai mult de 7-10 nt. Produse lungi de 2–6 n. nu sunt substraturi ADN polimerazei? și sunt numite abortive, Înainte de sinteza primerului ARN, ADN polimeraza? și primaza ADN acționează independent, iar după aceea activitățile lor sunt coordonate. Primerul ARN sintetizat se deplasează în situsul activ al polimerazei fără a se disocia în soluție. Această mișcare intramoleculară a primerului într-un duplex cu șablonul este rapidă și comparabilă ca viteză cu sinteza primerului. După ADN polimerază? extinde primerul, primaza începe sinteza unui nou primer, iar ciclul se repetă. Primaza ADN a eucariotelor diferă de alte ARN polimeraze prin capacitatea sa de a încorpora o dezoxiribonucleotidă în primer; primaza procariotelor are aceeași proprietate. Una dintre posibilele explicații pentru necesitatea includerii dNTP la capătul de 3" al primerului este necesitatea unei tranziții de la forma A la forma B a ADN-ului. Prin urmare, înțelegerea mecanismului de „comutație” a ADN-ului Complexul polimerază a-primază de la sinteza ARN la ADN este foarte important.Abilitate Capacitatea primazelor de a recunoaște simultan atât ribo- și deoxiribotrifosfați este de interes științific serios.

Alegerea primerului ARN este determinată de natura hidrofobă a interacțiunilor proteină-acid nucleic. În cazul unui hibrid ARN-ADN, duplexul este în formă A, ceea ce asigură un echilibru optim între interacțiunile hidrofobe și complementare dintre bazele șablonului și primerului.

După inițiere, creșterea primerului este însoțită de extracția bazelor șablon din cavitatea hidrofobă a proteinei pentru împerecherea bazelor cu catena de ARN în creștere. În condițiile unei astfel de competiții, di- și trinucleotidele scurte se disociază ușor, formând produse abortive. Pe măsură ce lungimea primerului crește, rezistența duplexului crește, influența hidrofobicității centrului activ slăbește, iar perechile de baze se apropie de axa helixului. Când lungimea primerului este de 7 n, sunt create condiții pentru încorporarea deoxinucleotidei și trecerea la forma B mai favorabilă din punct de vedere energetic. Aici este necesar să se țină cont de afinitatea mai mare pentru enzima dNTP în comparație cu NTP. Conceptul propus pare a fi de natură universală, deoarece un lucru similar are loc în timpul inițierii transcripției.

ADN polimeraza? leagă mai întâi matricea, apoi amorsa și substratul. ADN polimeraza? cel mai activ pe ADN-ul dublu catenar care conține goluri de cel puțin 20–30 nt în lungime. Regiunea de legare a șablonului pentru ADN polimerază? este destul de extins. Protejează puternic de hidroliză catena de primer 9 nt, regiunea dublu catenară de 13 nt și șablonul monocatenar de 14 nt și protejează slab mai multe baze din afara acestei regiuni. Enzima se leagă la 19–20 n din matrice prin interacțiuni ionice și hidrofobe, iar eficiența legării se corelează cu hidrofobicitatea bazelor matricei.

Care este caracteristica distinctivă a ADN polimerazei? este capacitatea sa de a extinde primerii ARN și asocierea sa puternică cu primaza ADN, care sintetizează acești primeri.

Procesivitate medie a ADN polimerazei? este 20–50 n. Primaza face rareori o greșeală atunci când sintetizează o dinucleotidă, dar apoi folosește cu ușurință NTP greșit. Deși viteza de încorporare a nucleotidelor eronate depinde de secvența de nucleotide a șablonului și de nucleotida incorectă în sine, în principiu, primaza ADN este cea mai inexactă enzimă de polimerizare a nucleotidelor. În unele cazuri, există o nucleotidă incorectă pentru fiecare 100 de nucleotide corecte. Încorporarea unei nucleotide incorecte nu împiedică includerea următoarei nucleotide corecte. Primaza poate polimeriza nucleotide similare și poate genera primeri cu erori multiple, care nu inhibă sinteza ulterioară și, după transferul intramolecular la situsul activ al ADN-polimerazei, sunt extinse de către ADN polimerază în prezența dNTP-urilor.

Există două modele pentru mecanismul de sinteză a primerilor care nu sunt complementare șablonului. Conform primului model, enzima include pur și simplu nucleotide care nu sunt complementare șablonului. Al doilea model implică includerea unei nucleotide complementare șablonului, urmată de alunecarea primerului față de șablon. Fidelitatea scăzută a primazei ADN a servit drept bază pentru ipoteza despre motivul pentru care ARN-ul este primerul pentru replicarea ADN-ului. Deoarece primele nucleotide pot fi încorporate în mod greșit într-o nouă catenă în creștere, primerul ARN se presupune că marchează regiunea „eroare mare” pentru excizia ulterioară și construcția mai precisă. Acest punct de vedere pare convingător, dar probabil motivul principal pentru apariția primerului ARN este încă asociat cu o inițiere mai eficientă a sintezei ADN-ului în prezența duplexului ARN-ADN în formă A.

Spre deosebire de primază, ADN polimeraza? este o enzimă destul de precisă. Ea face o medie de 1/30.000 până la 1/50.000 de erori. Factorii de replicare a proteinelor joacă un rol important în asigurarea specificității sintezei. În prezența RPA, este exactitatea ADN polimerazei? se ridică. Se știe că diferența de energii libere pentru formarea perechilor de baze regulate și incorecte în locul activ al polimerazei este aparent de 10 ori mai mare decât într-un mediu apos.

Forme cu greutate moleculară mare de ADN polimerază izolate din celule? poate avea alte activități în afară de ADN polimerază și primază. Aceste complexe sunt fragmente ale mecanismului de replicare al celulei. În complexul care realizează replicarea catenei principale, ADN polimeraza? asociat cu ADN polimeraza?, iar în complexul care sintetizează lanţul întârziat - cu ADN polimeraza?. La eucariote, ambele complexe sunt probabil conectate între ele la bifurcația de replicare, la fel cum holoenzimele pentru sinteza catenelor conducătoare și întârziate sunt conectate la procariote. Acest lucru este evidențiat de izolarea din celulele umane a unor complexe numite sintezomi și care conțin ADN polimeraze?,? și?, precum și o serie de alte proteine replicative, inclusiv primaza ADN, factorul replicativ RFC, PCNA, polimeraza poli(ADP-riboză) și ADN ligaza I. Din acest complex cu un nivel molecular înalt, ADN helicaza A cu greutate moleculară de 90 kDa şi 5" -> 3" exonuclează cu un mol. cu o greutate de 47 kDa. Cu ADN polimerază? proteina P1 din celulele de șoarece, care este un omolog al proteinei Mcm3 de drojdie, poate fi, de asemenea, asociată. Complexul ADN polimerază p-primază se disociază în timpul meiozei.

Antigenul T mare al SV40 (și al altor papovavirusuri) interacționează cu subunitățile p180 și p70 din complexul ADN polimerază p-primază și recrutează acest complex pentru ori virus. În timpul replicării ADN polimerazei papilomavirus? asociat cu helicaza virală E1.

Reglarea negativă a complexului în ciclul celular depinde nu numai de fosforilarea p180, ci și de fosforilarea subunității p68 de către kinazele dependente de ciclinA. În celulele de drojdie, complexul ADN polimerază p-primază este asociat cu cromatina în fazele G1 și S ale ciclului celular, dar nu G2/M. Legarea cromatinei depinde de defosforilarea subunității de 86 kDa (omologul p70) la sfârșitul mitozei.

4.3.1.5. ADN polimeraze? Și?

ADN polimeraza? este un heterodimer format dintr-o subunitate catalitică cu o masă moleculară de 125–130 kDa și o subunitate de 48–55 kDa, necesară pentru legarea la factorul de procesivitate PCNA (antigena nucleară celulară proliferativă). Subunitatea mică este necesară pentru ca enzima să depășească barierele structurale din matricele naturale monocatenare. De fapt, enzima nativă poate fi un tetramer care conține două subunități cu mase moleculare de 125 și 55 kDa, iar subunitatea de 55 kDa este un factor de dimerizare pentru holoenzimele replicative, cum ar fi subunitatea? în ADN polimeraza III E coli.În absența PCNA, ADN polimerază? are procesivitate scăzută pe șabloanele lungi monocatenare, iar în prezența PCNA procesivitatea crește de 10-100 de ori. Folosind mutanți cu deleție, s-a stabilit că în ADN polimerază? La șoareci, regiunea 129-149 reziduuri de aminoacizi din regiunea N-terminală a polipeptidei catalitice este responsabilă pentru legarea PCNA; domeniul C-terminal este mai puțin conservator și conține două situsuri de legare a ADN-ului.

ADN polimerază holoenzimă? include factorul de procesivitate PCNA și factorii RFC (factor de replicare C) și RPA, este asamblat pe complexul primer-șablon în următoarea ordine: în primul rând, RFC se leagă de capătul 3"-OH al primerului pe un singur catenar. Șablon de ADN, „acoperit” cu proteina RPA. Apoi, RFC, în prezența ATP, formează pe duplexul de ADN adiacent capătului de 3" al primerului o structură inelar de trei molecule PCNA cu o greutate moleculară de 36 kDa fiecare și PCNA asigură atașarea ADN polimerazei? până la capătul de 3" al primerului, completând astfel formarea unei holoenzime foarte procesive.

În PCNA în sine, au fost identificate regiunile responsabile de legarea la subunitățile RFC și la ADN polimeraze. La unirea ADN-ului cu polimeraza? sunt implicate reziduurile de aminoacizi 121–135, formând o buclă între domeniile PCNA.

Activitatea exonucleazei 3"->5" a ADN polimerazei? este, de asemenea, reglementată de factorii care alcătuiesc holoenzima. În absența factorilor auxiliari, activitatea exonucleazei 3"->5" a ADN polimerazei? este scăzut, dar în prezența proteinei RPA, ca ADN polimeraza?, crește de 8-10 ori. Efectul de activare al RPA asupra activității exonucleazei 3"->5" se datorează aparent destabilizarii complexului primer-matrice în prezența acestui complex proteic.

sinteza ADN polimerazei? în ciclul celular este reglat la nivel de transcripţie. Cantitatea de ARNm de enzimă și proteină atinge maximul la limita fazei G1/S. Dinamica sintezei ADN polimerazei? în ciclu corespunde dinamicii ADN polimerazei?. Interesant este că sinteza PCNA în timpul ciclului celular se corelează cu sinteza ADN polimerazei?, cu toate acestea, conținutul de PCNA crește constant și rămâne ridicat până la limita fazei G2/M. ADN polimeraza? este o fosfoproteină, cel mai înalt grad de fosforilare are loc în faza S. Fosforilarea subunității catalitice a ADN polimerazei de 125 kDa? este aparent efectuată de protein kinaza dependentă de ciclină specifică fazei G1 cdk2. Interesant este că fosforilarea subunității catalitice nu afectează activitatea sa enzimatică.

ADN polimeraza? umană conține două polipeptide - catalitice 261 kDa și 55 kDa. ADN polimeraza? drojdia este formată din cinci subunități: catalitică 256 kDa și subunități 80, 34, 31 și 29 kDa. subunitate de 80 kDa a ADN polimerazei? drojdia este un omolog al subunității de 55 kDa a enzimei din celulele de mamifere. Activitățile enzimatice - ADN polimeraza și exonucleaza 3"->5" - sunt asociate cu o polipeptidă cu greutate moleculară mare, al cărei domeniu N-terminal asigură ambele activități, iar domeniul C-terminal este necesar pentru a controla intrarea celulei în faza S a ciclului.

Care este particularitatea holoenzimei ADN polimerază? este dependența sa mai mică de factorii auxiliari PCNA, RFC și RPA în comparație cu holoenzima ADN polimerază? ADN polimeraza? este capabil să extindă procesiv sămânța pe șabloane monocatenare în absența PCNA. În prezența unui set complet de factori de replicare, crește procesivitatea sintezei și eficiența de legare a ADN polimerazei? cu grunduri. Există ideea că, pe șabloanele de ADN acoperite cu proteina RPA, factorii PCNA, RFC și ATP formează un „complex de recunoaștere a capătului 3”-OH-primer.” Locul de legare a ADN-polimerazei din molecula PCNA nu coincide cu ADN-ul. Situl de legare a polimerazei Acest lucru este evidențiat de faptul că diferitele forme mutante ale proteinei PCNA sintetizate de tulpinile pspa-79 și, respectiv, pspa-90 nu sunt capabile să interacționeze cu ADN polimerazele. Ca urmare, mutantul pspa-79 a afectat Sinteza ADN catalizată de ADN polimeraza?, iar în mutantul pspa-90 – ADN polimeraza?.

O altă diferență între holoenzimele ADN polimerază? Și? constă în ratele diferite de sinteză a ADN-ului. În condiții optime, rata de sinteză a ADN-ului de către holoenzima ADN polimerază? aproximativ cu un ordin de mărime mai mic decât viteza de sinteză a ADN polimerazei de către holoenzima?. Această diferență se datorează diferitelor funcții ale ADN polimerazelor la bifurcația de replicare. O holoenzimă ADN polimerază? efectuează sinteza rapidă și procesivă a catenei conducătoare, folosind pentru alungire un singur primer sintetizat în regiunea ori, și se disociază numai la atingerea capătului repliconului, și mai multe holoenzime ADN polimerază? poate sintetiza simultan fragmente Okazaki în „zona Okazaki” prin extinderea primerilor sintetizați de ADN polimerază?-primaza la începutul fiecărui fragment. În acest caz, ar trebui să aibă loc o schimbare rapidă a ADN polimerazei, însoțită de disociere după terminarea sintezei fragmentului și asocierea cu primerul fragmentului următor. În sinteza fragmentelor de caten întârziate, atunci când concentrația de primeri este mare și mai multe fragmente pot fi sintetizate simultan, viteza de polimerizare este mai puțin importantă decât capacitatea de a trece rapid de la un fragment Okazaki la altul.

ADN polimeraze, ? și?, au activitate exonuclează 3"->5", care îndeplinește o funcție de corectare în timpul sintezei ADN-ului, dar ratele de eroare în timpul sintezei catenelor conducătoare și întârziate diferă. Acest lucru se datorează faptului că o parte din ADN-ul catenei întârziate este sintetizată de ADN polimeraza, care este capabilă să sintetizeze ADN-ul cu un număr mare de erori.

4.3.1.6. ADN polimeraza?

Această polimerază este localizată în mitocondrii, funcția sa este asociată cu replicarea și repararea ADNmt. ADN-polimerazele sunt heterodimeri constând dintr-o subunitate catalitică mare de 125–140 kDa, care are activități de ADN polimerază și exonuclează 3’->5” și o subunitate auxiliară de 35–50 kDa, a cărei funcție este necunoscută. Ca și altele, mtDNA enzime de replicare, ADN polimeraza? este codificată de genomul nuclear Structura primară a ADN polimerazei? este similară cu structura ADN polimerazei I E coli,în special în regiunea centrilor catalitici, în domeniul exonucleazei N-terminal 3"->5" și domeniul polimerazei C-terminal.

Sfârșitul perioadei de încercare gratuită.